外源基因在馬鈴薯體內(nèi)表達的研究

《外源基因在馬鈴薯體內(nèi)表達的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、摘要摘要本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將禽流感病毒H5N1亞型血凝素基因（H5HA）、麥芽糖乙?；D(zhuǎn)移酶基因（MAA）和大腸桿菌腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）編碼基因（glgC）導(dǎo)入馬鈴薯栽培品種Desiree中，對外源基因在馬鈴薯體內(nèi)的表達情況進行分析，結(jié)果如下：1.將禽流感病毒H5HA基因分別與馬鈴薯淀粉結(jié)合型淀粉合酶I（GBSSI）基因啟動子（Gp）、甘薯貯藏蛋白A（SpoA）基因的啟動子（Sp）和花椰菜花葉病毒（CaMV）35S基因的啟動子（35Sp）融合，構(gòu)建了pBIN19/Gp-H5HA，pBIN19/Sp-H5HA和pBIN19/35Sp-H5HA三

2、個植物表達載體，研究不同啟動子驅(qū)使下重組基因在馬鈴薯體內(nèi)的表達。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對馬鈴薯進行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPTII）抗性篩選后，Gp-H5HA系列共獲得10株，Sp-H5HA系列共獲得8株，35Sp-H5HA系列共獲得12株。PCR結(jié)果表明，H5HA重組基因成功整合到馬鈴薯基因組中。除此之外，對35Sp-H5HA系列的10個轉(zhuǎn)基因株系進行RT-PCR和Western斑點雜交分析，結(jié)果表明H5HA重組基因在馬鈴薯體內(nèi)得到表達。2.從大腸桿菌中克隆了編碼MAA的基因片段，并將該片段與環(huán)狀芽孢桿菌環(huán)狀糊精糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase）的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域（SBD）

3、連接，構(gòu)建了在馬鈴薯GBSSI啟動子驅(qū)動下的重組基因的植物表達載體pBIN19/MAA-SBD和pBIN19/SBD-MAA，它們分別用于MAA-SBD（SBD在C-末端）和SBD-MAA（SBD在N-末端）基因在馬鈴薯薯塊中的表達。與此同時，構(gòu)建了pBIN19/MAA對照質(zhì)粒，用于檢測MAA蛋白自身是否與淀粉粒之間有親和性。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化馬鈴薯，經(jīng)NPTII抗性篩選后，三個系列共獲得25個轉(zhuǎn)基因株系，PCR分析結(jié)果表明，MAA和MAA/SBD重組基因已分別整合到馬鈴薯基因組中。3.將大腸桿菌中編碼腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的glgC基因的序列與馬鈴薯GBSSI啟動子

4、融合構(gòu)建了pBIN19/glgC植物表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化馬鈴薯，經(jīng)NPTII抗性篩選后，共獲得10個再生株系。經(jīng)PCR檢測，其中9株為轉(zhuǎn)基因植株。這一結(jié)果表明，glgC重組基因已轉(zhuǎn)入并整合進馬鈴薯基因組中。本研究的結(jié)果對利用馬鈴薯作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)基因工程疫苗和對馬鈴薯淀粉分子結(jié)構(gòu)改良，在馬鈴薯薯塊中合成新型淀粉具有重要的理論意義和現(xiàn)實意義。關(guān)鍵詞：馬鈴薯，生物反應(yīng)器，H5HA，SBD，MAA，glgC，疫苗，新型淀粉IAbstractAbstractInthisstudy,H5N1subtypeavianinfluenzavirushemagglutining

5、ene(H5HA),E.colimaltoseacetyltransferasegene(MAA)andtheE.coliADP-glucosepyrophosphorylase(AGPase)codinggene(glgC)were,respectively,transformedintothepotatocultivarDesireebyusingAgrobacteriumtumefaciens-mediated.Theexpressionofgenesinthepotatowasanalyzedandtheresultsareasfollows:1.TheH5HA-

6、encodingcDNAfragmentwas,respectively,fusedtothepromoterfragmentsofpotatogranule-boundstarchsynthase(Gp),sweetpotatoSporaminA(Sp)andcauliflowermosaicvirus(CaMV)35S(35Sp).pBIN19vectorwiththeNOSterminatorwasusedforcloningtheH5HArecombinantgenes.pBIN19/Gp-H5HA,pBIN19/Sp-H5HAandpBIN19/35Sp-H5H

7、Abinaryvectorswereobtainedandtransformed,respectively,intoapotatocultivar(cv.Desiree)byusingAgrobacterium-mediadatetransformation.ATotalof10transgenic,root-formingshootsofGp-H5HAseries,8ofSp-H5HAseriesand12of35Sp-H5HAserieswereharvestedandmultiplied.PCRresultsshowed