外源基因在畢赤酵母中表達(dá)水平的預(yù)測(cè)

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1、外源基因在畢赤酵母中表達(dá)水平的預(yù)測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析鑒定分析其他目的基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的概率綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)-2第一部分：外源基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的預(yù)測(cè)第二部分：畢赤酵母蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析鑒定第三部分：分析其他目的基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的概率此實(shí)驗(yàn)共包括如下三個(gè)部分在科研和臨床中需要大量的蛋白質(zhì)，這些蛋白不可能由人體組織或體外細(xì)胞培養(yǎng)而大規(guī)模的獲得，人們利用一些低等生物的特點(diǎn)，來(lái)生成和獲得這些人屬蛋白質(zhì)。酵母菌是單細(xì)胞真核生物，具有生長(zhǎng)快、易于遺傳操作、能對(duì)外源蛋白進(jìn)行翻譯后

2、加工和修飾、不產(chǎn)生有毒產(chǎn)物等特點(diǎn)，被認(rèn)為是表達(dá)外源蛋白的合適宿主。幾種工業(yè)酵母尤其是巴氏畢赤酵母(pichiapastoris,Pp)，因具有旺盛的生長(zhǎng)力以及其它一些獨(dú)特的性質(zhì)，已發(fā)展成為較成熟的蛋白生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母以甲醇為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。由畢赤酵母表達(dá)應(yīng)用于臨床的蛋白目前有胰島素，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、腫瘤壞死因子(TNF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、人血清白蛋白，以及多種抗體等。第一部分：外源基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的預(yù)測(cè)微觀的酵母細(xì)胞5'AOX1啟動(dòng)子片段含有AOX1啟動(dòng)子，在甲醇的誘導(dǎo)下可啟動(dòng)外源蛋白的表達(dá)；α-因子信號(hào)

3、肽序列為約89個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中，更利于外源蛋白的純化；多克隆位點(diǎn)含多個(gè)酶切位點(diǎn)，為外源基因的插入提供位點(diǎn)；TT序列提供有效的轉(zhuǎn)錄終止和polyA修飾信號(hào)；HIS4為營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)志；3'AOX1基因片段能夠與基因組AOX1基因?qū)偻粗亟M；抗Amp基因和pBR322能使空載體和構(gòu)建的表達(dá)載體在E.coli中篩選和復(fù)制。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用載體的基本結(jié)構(gòu)pPIC9載體的信號(hào)肽序列和多克隆位點(diǎn)1.載體的3'AOX1區(qū)與基因組的AOX1基因的末端發(fā)生整合重組表達(dá)載體與畢赤酵母基因組發(fā)生重組的兩種方式：2.載體

4、的HIS4區(qū)與基因組的HIS4基因的末端發(fā)生整合重組甲醇酵母系統(tǒng)高效表達(dá)影響因素載體穩(wěn)定性：是整合還是粘附到酵母染色體上基因劑量：?jiǎn)?多拷貝甲醇利用表型：Muts(利用甲醇慢型)，Mut+(利用甲醇快型)mRNA5′端：應(yīng)盡量避免在UTR區(qū)出現(xiàn)AUG和次級(jí)結(jié)構(gòu)AT含量：AT含量越高、越容易出現(xiàn)類(lèi)似于終止子的結(jié)構(gòu)表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性：分泌表達(dá)時(shí)，胞外蛋白酶是要影響因素外源基因的3'末端的最低自由能穩(wěn)定性對(duì)于實(shí)現(xiàn)目的基因在畢赤酵母中成功高效表達(dá)是比較重要的因素，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民教授課題組聯(lián)合北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院李伍舉教授

5、課題組建立了一個(gè)針對(duì)pPIC9表達(dá)載體在畢赤酵母中高效表達(dá)的數(shù)學(xué)模型。模型構(gòu)建原理收集40例應(yīng)用pPIC9載體在畢赤酵母GS115株中表達(dá)目的基因的數(shù)據(jù)。擬定以表達(dá)量100mg/L為界限，將40例目的基因表達(dá)水平分為高/低兩組。確認(rèn)表達(dá)載體的翻譯終止密碼子前后各100bp的序列，據(jù)此對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)構(gòu)建200bp的片段。從上述每個(gè)基因的200bp片段，截取9,000個(gè)區(qū)間，截取方式為[X,Y],X和Y在200bp片段的范圍為1≤X≤100,和111≤Y≤200。使用RNAfold軟件對(duì)每個(gè)區(qū)間計(jì)算最低自由能，構(gòu)建最低自由能矩陣。使用Tclass

6、程序?qū)ψ畹妥杂赡芫仃囘M(jìn)行t檢驗(yàn)及判別分析，得到理論上可以判別表達(dá)水平高低的6個(gè)區(qū)間組合。我們將40例數(shù)據(jù)按75％的比例隨機(jī)分成兩組，多數(shù)組應(yīng)用上述6個(gè)區(qū)間來(lái)建立判別函數(shù)，如此重復(fù)1,000次，這樣我們得到了1,000個(gè)判別函數(shù)，如第一個(gè)判別函數(shù)為：HEG1=－20.20203＋0.52552X1－2.35843X2＋1.53122X3－2.24870X4－1.19898X5＋1.53908X6(1)LEG1=－14.37028＋0.00749X1－0.04135X2－0.87256X3＋2.02204X4＋0.15215X5－0.7449

7、5X6(2)這里的X1,X2,X3,X4,X5和X6分別代表區(qū)間[18,123]，[31,140]，[35,150]，[90,118]，[90,151]和[95,135]的用RNAfold軟件計(jì)算的最低自由能（計(jì)算溫度參數(shù)設(shè)為30℃）。對(duì)于每個(gè)新數(shù)據(jù)，為了預(yù)測(cè)該基因是否能在酵母中高效表達(dá)（表達(dá)水平大于100mg/L），可先計(jì)算這6個(gè)區(qū)間的最低自由能，然后運(yùn)算上述的1,000個(gè)判別函數(shù)，來(lái)評(píng)估該基因高效表達(dá)的概率。如果在這1,000次的判別分析中，有500次或以上的HEG1大于LEG1，那么這個(gè)外源基因?yàn)橐粋€(gè)表達(dá)水平大于100mg/L的基因

8、，否則就是個(gè)表達(dá)水平低于100mg/L的基因。外源基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)預(yù)測(cè)的網(wǎng)頁(yè)服務(wù)器http://ppic9.md.stu.edu.cn/ppic9分析流程：在“sequence