畢赤酵母表達系統(tǒng)在外源基因表達中的

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1、畢赤酵母表達系統(tǒng)在外源基因表達中的研究進展及應(yīng)用中國生物工程雜志ChinaBiotechnology,2006,26(1):87～91張伍魁*范清林宋禮華（安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院合肥230032）摘要巴斯得畢赤酵母（Pichiapastoris）表達系統(tǒng)作為一個日臻完善的外源蛋白真核表達系統(tǒng)由于它所具有的一些其它表達系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)勢而得到越來越廣泛的應(yīng)用。分別從該表達系統(tǒng)的優(yōu)點、外源基因整合及調(diào)控機理、表達蛋白糖基化及翻譯后修飾等方面綜述了其在外源蛋白表達中的研究進展及應(yīng)用。關(guān)鍵詞巴斯得畢赤酵母外源基因糖基化中圖分類號Q786收稿日期：20051227修回日期：2005

2、1116*電子信箱：wukui007@sina.com巴斯得畢赤酵母（Pichiapastoris）表達系統(tǒng)是上世紀(jì)80年代初期發(fā)展起來的一種新型的外源蛋白表達系統(tǒng)［1］，它既具有原核表達系統(tǒng)操作簡易、易于培養(yǎng)、生長速度快、表達量高、成本低等優(yōu)點，還具有原核生物表達系統(tǒng)所不具有的對外源蛋白的翻譯后修飾等特點，如糖基化、蛋白磷酸化等。同時它還避免了釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）分泌效率差、表達菌株不夠穩(wěn)定、表達質(zhì)粒易丟失等缺陷［2］。除此之外，由于它在蛋白質(zhì)表達方面還具有以下幾個其它表達系統(tǒng)所不可比擬的優(yōu)點而使得該系統(tǒng)成為目前研究最多、應(yīng)用最廣泛

3、的真核表達系統(tǒng)之一：(1)它所具有的aox啟動子是一種強有力的啟動子，受甲醇嚴(yán)格誘導(dǎo)調(diào)控而表達，所以可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達；(2)由于它可以對表達蛋白進行糖基化、蛋白磷酸化、折疊、信號序列加工、脂類酰化等一系列的翻譯后修飾，從而使其表達的蛋白具有生物活性；(3)表達量高，迄今為止，已有300多種異源蛋白在該表達系統(tǒng)中獲得了高效表達，如破傷風(fēng)毒素片段C可達12g/L［3］，而明膠的表達量甚至達到了14.8g/L［4］，已有報道其胞內(nèi)表達量驚人，甚至達到了22g/L；(4)外源基因的表達產(chǎn)物既可存在于胞內(nèi)，又可通過其特有的信號肽α因子或天然蛋白本身的信號肽分泌至細(xì)胞外，同時，

4、該系統(tǒng)自身分泌的蛋白非常少，這大大簡化了純化過程，如表達的重組水蛭素（HIR），僅經(jīng)過二步層析純化就可達到97％以上的純度；(5)整合入外源基因的重組子表達系統(tǒng)十分穩(wěn)定。有文獻報道通過同源重組整合入外源基因的重組子表達系統(tǒng)可連續(xù)培養(yǎng)50代卻未見外源基因丟失的現(xiàn)象［5］；(6)糖基化程度低，畢赤酵母中加到外源蛋白每條側(cè)鏈的平均長度為8~14個甘露糖殘基，較之釀酒酵母每條側(cè)鏈平均50~150甘露糖殘基要短得多［6］，同時，由于畢赤酵母不能象釀酒酵母那樣在核心多糖末端形成α1,3末端甘露糖，使得它的蛋白抗原性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于后者。因而更適合于治療用途［7］；(7)該表達系統(tǒng)由于對營養(yǎng)要

5、求低，培養(yǎng)基成份簡單廉價，可進行高密度高產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)，便于工業(yè)化生產(chǎn)。1常用表達菌株及表達載體1.1表達菌株P(guān).pastoris作為一種甲醇利用型酵母菌，自1969年開發(fā)以來，通過數(shù)十年的研究，至今已有多個種屬被開發(fā)出來，新近發(fā)展起來的嗜甲醇酵母包括Candida和Pichia2個種屬，共有30余種［8］，其中尤以P.pastoris發(fā)展最快，研究最清楚。目前，用于外源基因表達的P.pastoris菌株為Invitrogen公司構(gòu)建，主要有：Y11430，MG1003，GS115，KM71和SMD1168，其中Y11430為野生型，其余皆為組氨酸突變型，GS115有

6、完整的aox1基因，在甲醇培養(yǎng)基上表型為Mut+，當(dāng)用重組表達載體轉(zhuǎn)化后，由于表達載體線化所用酶不同，其轉(zhuǎn)化子表型可能是Mut+或Muts，可通過MD和MM培養(yǎng)基進行表型的鑒定；KM71的aox1基因被ARG4基因替代，雖然aox2和aox1有97％同源性，但aox2利用甲醇的能力遠(yuǎn)比aox1弱［9］，在甲醇培養(yǎng)基上表現(xiàn)為Muts，其轉(zhuǎn)化子也是Muts，表型不必鑒定。SMD1168為蛋白酶缺陷型菌株，特別適用于分泌表達載體，可避免表達外源蛋白被宿主菌同時表達的蛋白酶所降解，其它蛋白酶缺陷型主要還有SMD1165和SMD1163［10］。MC1003的aox基因全部刪除，不能

7、利用甲醇，即表型為Mut－His－。1.2表達載體P.pastoris沒有穩(wěn)定的附加體質(zhì)粒，所以一般用整合型載體作為外源基因的表達載體，目前常用的表達載體多是美國Invitrogen公司開發(fā)構(gòu)建的。P.pastoris既有分泌表達型的，又有胞內(nèi)表達型的。常用的表達載體主要有：pPIC9，pPIC9K，pHILS，pAO815，pHILD2和pPICz等，其中pPIC9，pPIC9K和pHILS為分泌型表達載體，而pAO815，pHILD2和pPICz為胞內(nèi)型表達載體，不同載體除具有各自特殊的基因