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1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文人肥胖基因在畢赤酵母中的表達(dá)姓名：聶芬申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：水生生物學(xué)指導(dǎo)教師：龍良啟20060601人肥胖基岡在畢赤酵母中的表達(dá)摘要肥胖基因編碼的蛋白質(zhì)(1eptin)是反映體內(nèi)脂肪含量和調(diào)節(jié)體重的重要信號(hào)因子，leptin能顯著降低脂肪組織數(shù)量、促進(jìn)青春期發(fā)育，對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答、繁殖功能、神經(jīng)內(nèi)分泌等功能具有重要的作用。本文根據(jù)己報(bào)道的人肥胖基因cDNA序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出人肥胖基因的cDNA編碼序列，然后將此定向克隆至畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K的a因子信號(hào)肽編碼序列37端，構(gòu)建成重組酵母表達(dá)載體，測(cè)序分
2、析表明該cDNA序列由438個(gè)核苷酸組成，編碼146個(gè)氨基酸組成的多肽。用化學(xué)方法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSll5，經(jīng)PCR鑒定證實(shí)，目的基因整合到重組酵母菌染色體中，對(duì)重組酵母進(jìn)行G418篩選和4天的誘導(dǎo)表達(dá)，然后對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行了為期4天的誘導(dǎo)表達(dá)，SDS．PAGE未檢測(cè)到目的產(chǎn)物的表達(dá)。根據(jù)巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏愛(ài)性，對(duì)肥胖基因進(jìn)行了簡(jiǎn)并改造和人工合成，然后將改造過(guò)的人肥胖基因以正確的讀碼框架插入到酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K的a因子信號(hào)肽編碼序列37端，構(gòu)建成重組酵母表達(dá)載體，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。重組酵母用同樣方法進(jìn)行了為期4天的誘導(dǎo)表達(dá)，
3、并通過(guò)SDS—PAGE和放免檢測(cè)，得到一株表達(dá)目的蛋白量最高的重組酵母菌，該重組蛋白表達(dá)水平可達(dá)7．71mg／L，不同濃度G418篩選表明該酵母菌是高拷貝的。SDS．PAGE檢測(cè)表明分泌蛋白分子量約為16kD。關(guān)鍵詞：肥胖基因；瘦素；畢赤酵母；克??；表達(dá)華中農(nóng)業(yè)人學(xué)2006屆碩上學(xué)位論義AbstractTheexpressionproductofobgene—leptinisanimportantsignalreflectingbodyfatmassandcontrollingweight，itCanremarkablycutdowntheamou
4、ntsoffatmass、stimulatethedevelopmentoftheadolescenceandalsoplaysanimportantroleintheimmunefunction，reproduction，neuroendocrinesecretion．SpecificprimersweredesignedtoamplifythecDNAfragmentencodinghumanleptin，then，thecDNAfragmentWasinsertedintothe3-endofCt—factorofyeastexpressio
5、nvectorpPIC9K．DNASequenceanalysisrevealedthatitconsistedof438nucleotidesthatencodeda146-aminopeptide．TherecombinantplasmidpPIC9K-obwastransformedintothegenomeofGS15bychemicalmethod．Thepositivetransformantswereinducedbymethan01．TheresultofSDS-PAGEdemonstratedthatthegenenearlyco
6、uldn’tbeexpressed．Togetahigherexpressionofhumanleptin，thehumanobgeneWasmodifiedandsynthesizedbymanualinthebasisofcodonbias，therecombinantplasmidwasconstructedandtransformedintothegenomeofGS15．ThemutipleinserttransformantswerescreenedbyG418andinducedbymethan01．After4daysofmetha
7、nolinduction，humanleptinwassecretedintothemedium．TheconcentrationofleptinexpressionsupematantWasabout7．71mg／LbyIRA．TheresultofSDS—PAGEdemonstratedthattheweightofthesecretedproteinWasapproximately16kD．Keywords：Obesegene；Leptin；Ppastoris；Cloning；ExpressionU人肥胖基因在畢赤酵母中的表達(dá)縮寫(xiě)AmpBMM
8、YBMGYbp(s)BisddH20dNTPDTrEBEDTAghkbkDaLBmgmlnmLMMMDoboD0nPAGE
