最新外源基因在真核細胞中表達及調控-藥學醫(yī)學精品資料.ppt

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1、最新外源基因在真核細胞中表達及調控-藥學醫(yī)學精品資料第一節(jié)???????真核細胞基因表達的調控一、真核生物基因表達的特點及優(yōu)勢二、真核細胞表達及調控元件第二節(jié)???????哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的選擇標記基因一、胸苷激酶基因選擇標記（定義）二、二氫葉酸還原酶基因選擇標記三、新霉素抗性基因選擇標記四、氯霉素已酰轉移酶基因選擇標記五、黃嘌呤-鳥嘌呤轉移酶（XGPRT）基因胸苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶簡稱胸苷激酶（thymidineKinase,TK）在所有真核細胞中都有表達,是嘧啶生物合成補救代謝途徑中的一個關鍵酶,它可催化胸苷磷酸化轉變成為dTMP,繼續(xù)磷酸化生成dTTP,參與D

2、NA的生物合成。一、載體的類型1.質粒型載體2.病毒載體3.整合型表達載體4.游離型表達載體5.瞬時表達載體6.穩(wěn)定性表達載體7.非復制性HSV-Ⅰ病毒（單純皰疹病毒HSV-Ⅰ型）載體8.裂解性HSV-Ⅰ病毒載體二、幾種常用的真核表達載體㈠逆轉錄病毒載體1.卸甲載體2.穿梭載體㈡痘類病毒載體㈢HSV-Ⅰ單純皰疹病毒載體1.重組病毒型載體2.重組質粒型載體3.裂解型病毒載體（一）真核生物基因轉錄水平的調控基因調控的順式作用元件啟動子增強子RNA剪接信號負調控元件終止子和polyA信號基因調控的反式作用因子概念反式作用因子主要作用規(guī)律（二）轉錄后水平的調控mRNA前體加工：轉

3、錄的mRNA前體經(jīng)5’加帽，3’酶切加尾去除內含子后，產(chǎn)生成熟mRNA，通過核孔進入胞質中。RNA編輯（RNAediting）（三）翻譯水平的調控翻譯起始序列eIF-2的磷酸化反應由模板來源的遺傳信息，進而可編碼產(chǎn)生不同氨基酸序列的多種蛋白質，這是生物適應性的保護措施。順式作用元件順式作用元件為一些能與DBP結合的特定序列DNA片段,位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,決定轉錄起始位點和RNA聚合酶的轉錄按效應和功能可分為啟動子、增強子、RNA間接信號、負調控元件、終止子等調控元件。反式作用因子主要作用規(guī)律同一DNA序列可被不同蛋白質識別同一蛋白質因子可與多種不同

4、DNA序列發(fā)生聯(lián)系，多數(shù)是通過蛋白質-蛋白質先相互作用后，再與DNA結合，發(fā)揮調節(jié)作用。反式作用因子的自身生物合成有相當大的可變性、可塑性。反式作用因子與順式作用元件相互作用的特定結構域，有兩種類型：通用轉錄因子的結構域為識別特異DNA的DNA結合結構域，如：鋅指結構。轉錄調節(jié)因子的結構域又稱轉錄活化結構域，如：酸性α-螺旋結構域。不同結構域各自的特征不同結構域各自的特征通用轉錄因子的DNA結合結構域鋅指結構亮氨酸拉鏈螺旋-轉角-螺旋（HTH）螺旋-環(huán)-螺旋轉錄調節(jié)因子的轉錄活化結構域RNA編輯（RNAediting）RNA編輯是在轉錄時或轉錄后，能夠改變RNA分子編碼特

5、性，是與剪切形式不同的一種修飾形式，如可使mRNA某位點密碼子CAA轉變?yōu)閁AA，使C變U，編輯的結果形成了UAA終止密碼子，在編碼酶的作用下，除使C變U，還可在RNA上添加多個U或呈單個C的添加，使前體mRNA變成成熟mRNA時，通過插入或替換方式，可改變和擴大原遺傳信息，編碼多種蛋白,是生物的適應性保護。翻譯起始序列在ATG起始密碼子周圍要有5’-CCACCA-TGG-3’保守序列，以利mRNA翻譯起始，若發(fā)生突變，其翻譯水平可下降10倍。在起始AUG上游若有比較多的二級結構序列，也會影響翻譯，建議外源基因的5’端AUG上游序列不宜過長。eIF-2的磷酸化反應eIF-

6、2為轉譯起始因子-2是蛋白質合成起始階段13種起始因子中最為關注的因子。若轉入動物細胞中的質粒DNA的兩條鏈一旦都發(fā)生轉錄，就會形成雙鏈互補mRNA，而激活胞內的雙鏈RNA激活的蛋白激酶（DAIPK）該激酶可使eIF-2的α-亞基磷酸化，轉譯受抑，為防止該激酶活化，常在載體上加上腺病毒的VARNA基因，VARNA是由RNA聚合酶Ⅲ合成的小分子RNA，能阻止雙鏈RNA對DAI激酶的激活作用，使轉譯得以正常進行。一、胸苷激酶基因選擇標記外源基因+載體(TK+)的重組體導入TK-細胞中，在HAT（次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷）選擇培養(yǎng)基中篩選，TK-細胞因氨基喋呤抑制了dT

7、TP的合成而死亡，TK+細胞可存活，以此進行篩選。（HSV-1的TK基因轉染細胞加GCV后被殺死，如小鼠LMTK-細胞。）注：TK++BrUdR因摻入后對紫外線敏感而死亡，TK-+BrUdR因不摻入，對紫外線不敏感而存活。二、二氫葉酸還原酶基因（DHFR）選擇標記DHFR是合成dATP和dGTP的關鍵酶。常用DHFR—的CHO細胞因不能合成四氫葉酸，只能在含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培養(yǎng)基中生長。在不含該培養(yǎng)基中導入該標記基因重組子，則可篩選出陽性克隆，也可將DHFR基因置在強啟動子下高表達或通過DHFR基因突變以提高抵抗高