08第九章外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá).ppt

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1、一、選擇標(biāo)記和報(bào)告基因二、DNA直接導(dǎo)入的基因轉(zhuǎn)化方法三、農(nóng)桿菌作載體的植物轉(zhuǎn)基因方法四、外源基因轉(zhuǎn)化在基因表達(dá)調(diào)控研究中的應(yīng)用五、反義RNA及其在基因表達(dá)調(diào)控中的作用六、RNA干擾第九章外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)一、選擇標(biāo)記和報(bào)告基因在將外源目的基因轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞時(shí)，必須分辨出哪些細(xì)胞被轉(zhuǎn)化了，哪些細(xì)胞沒有被轉(zhuǎn)化。將一個(gè)選擇標(biāo)記與外源目的基因連接，被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞就帶有選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記常用抗生素抗性基因，真核生物細(xì)胞所用的抗生素與原核細(xì)胞有所不同。真核生物細(xì)胞中的選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記之一二氫葉酸還原酶基因二氫

2、葉酸還原酶（dihydrofolatereductase,DHFR）對(duì)于真核細(xì)胞核苷酸（胸腺嘧啶）的合成是必需的。對(duì)營養(yǎng)缺陷型dhfr－細(xì)胞來說，二氫葉酸還原酶基因可用作選擇標(biāo)記，在缺少胸腺嘧啶和次黃嘌呤的選擇培養(yǎng)基中篩選出轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞。選擇標(biāo)記之一二氫葉酸還原酶基因氨甲喋呤（methotrexate,MTX）和三甲氧芐二氨嘧啶（trimethoprim）是二氫葉酸類似物，是二氫葉酸還原酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，當(dāng)培養(yǎng)基中含有MTX時(shí)，二氫葉酸不能轉(zhuǎn)變成四氫葉酸而生長受到抑制。有一種突變的DHFR，它不受MTX

3、的抑制，以它作選擇標(biāo)記，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可在含MTX的培養(yǎng)基上生長。選擇標(biāo)記之二胸苷激酶基因tk－的宿主細(xì)胞在正常的培養(yǎng)基中可以生長，但在含有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸苷（T）的培養(yǎng)基中不能生長。這是因?yàn)榘被┻室种屏硕淙~酸還原酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞不能合成TTP。若將tk＋基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，雖然氨基喋呤抑制了核苷酸的從頭合成途徑，但培養(yǎng)基中的次黃嘌呤可以通過補(bǔ)救途徑轉(zhuǎn)變成ATP和GTP，胸苷通過胸苷激酶的作用可以轉(zhuǎn)變成TTP（CTP可以按正常途徑合成），所以被tk基因轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞可

4、以在HAT培養(yǎng)基中生長。選擇標(biāo)記之三新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neomycinphospho-transferaseⅡgene,nptⅡ）是一個(gè)來源于轉(zhuǎn)座子Tn5編碼的分子量為25KD的酶，它催化許多氨基糖苷類抗生素（如新霉素、慶大霉素、卡那霉素、G-418）的磷酸化反應(yīng)，將ATP上的γ磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到抗生素分子上，阻止了它們與靶位點(diǎn)——核糖體的相互作用，從而使這些抗生素失去對(duì)細(xì)胞的毒性。這類抗生素的毒理作用是與葉綠體及線粒體核糖體的30S亞基結(jié)合，阻止70S核糖體形成。選擇標(biāo)記之四潮霉素

5、磷酸轉(zhuǎn)移酶基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（hygromycinphospho-transferase，HPT）可使潮霉素B磷酸化而失去毒性。潮霉素B可抑制核糖體的功能，使細(xì)胞不能合成蛋白質(zhì)，因此對(duì)大多數(shù)植物和動(dòng)物細(xì)胞均有毒性。選擇標(biāo)記之五氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因氯霉素能抑制真核細(xì)胞線粒體中的蛋白質(zhì)合成，而氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloramphenicolacetyltransferase，CAT）能使氯霉素乙?；?，從而失去毒性。選擇標(biāo)記之六抗除草劑基因除草劑PPT是一種谷氨酸類似物，它競(jìng)爭(zhēng)性地抑制植物體內(nèi)谷氨酰胺合成酶

6、（GS）的活性。谷氨酰胺合成酶催化下列反應(yīng)，起到解氨毒的作用。當(dāng)PPT存在時(shí)，GS活性被抑制，細(xì)胞內(nèi)NH4+積累，細(xì)胞中毒而死亡。選擇標(biāo)記之六抗除草劑基因PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT）可以催化乙酰CoA分子上的乙酰基轉(zhuǎn)移到PPT分子的游離氨基上，乙?；说腜PT失去對(duì)GS的抑制作用，從而使轉(zhuǎn)化了pat基因的植物表現(xiàn)出對(duì)PPT的抗性。用硅膠G薄層層析可以分離和分析乙?；腜PT，從而測(cè)定PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，所以pat基因也可以當(dāng)作報(bào)告基因。報(bào)告基因報(bào)告基因（reportergene）可用于研究基因調(diào)控和轉(zhuǎn)

7、化基因的表達(dá)情況。報(bào)告基因一般是一種酶的基因，對(duì)報(bào)告基因的要求是在受體細(xì)胞中沒有其產(chǎn)物，產(chǎn)物容易檢測(cè)。報(bào)告基因之一β-葡糖醛酸糖苷酶基因β-葡糖醛酸糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）是目前應(yīng)用最廣泛的報(bào)告基因之一。它以x-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖醛酸）為底物，催化產(chǎn)生藍(lán)色的5,5’-二溴-4,4’-二氯靛藍(lán)沉淀，可用來觀察轉(zhuǎn)化基因的組織化學(xué)定位。還可以4-MUG（4-甲基傘形酮葡糖苷酸）為底物，催化產(chǎn)生4-甲基傘形酮，產(chǎn)物用熒光分光光度計(jì)測(cè)定，此法可測(cè)定基因表達(dá)的強(qiáng)度。

8、報(bào)告基因之二氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因CAT也能用作報(bào)告基因。用14C標(biāo)記的氯霉素、乙酰CoA與細(xì)胞、組織提取物反應(yīng)，薄層層析法分離反應(yīng)產(chǎn)物，放射自顯影可測(cè)得CAT活性。氯霉素的結(jié)構(gòu)式2,2-二氯-N-(1R,2R)-1,3二羥基-1-(4硝基苯基)丙-2-基乙酰胺氯霉素催化的反應(yīng)及檢測(cè)方法報(bào)告基因之三熒光素酶基因熒光素酶（luciferase，LUX）基因取自熒火蟲或發(fā)光細(xì)菌，在ATP和Mg2+存在下，催化熒光素氧化發(fā)光?？捎冒l(fā)光光度計(jì)測(cè)定。