08第九章外源基因在真核細胞中的表達.ppt

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1、一、選擇標記和報告基因二、DNA直接導入的基因轉(zhuǎn)化方法三、農(nóng)桿菌作載體的植物轉(zhuǎn)基因方法四、外源基因轉(zhuǎn)化在基因表達調(diào)控研究中的應用五、反義RNA及其在基因表達調(diào)控中的作用六、RNA干擾第九章外源基因在真核細胞中的表達一、選擇標記和報告基因在將外源目的基因轉(zhuǎn)化真核細胞時，必須分辨出哪些細胞被轉(zhuǎn)化了，哪些細胞沒有被轉(zhuǎn)化。將一個選擇標記與外源目的基因連接，被轉(zhuǎn)化的細胞就帶有選擇標記。選擇標記常用抗生素抗性基因，真核生物細胞所用的抗生素與原核細胞有所不同。真核生物細胞中的選擇標記選擇標記之一二氫葉酸還原酶基因二氫

2、葉酸還原酶（dihydrofolatereductase,DHFR）對于真核細胞核苷酸（胸腺嘧啶）的合成是必需的。對營養(yǎng)缺陷型dhfr－細胞來說，二氫葉酸還原酶基因可用作選擇標記，在缺少胸腺嘧啶和次黃嘌呤的選擇培養(yǎng)基中篩選出轉(zhuǎn)化了的細胞。選擇標記之一二氫葉酸還原酶基因氨甲喋呤（methotrexate,MTX）和三甲氧芐二氨嘧啶（trimethoprim）是二氫葉酸類似物，是二氫葉酸還原酶的競爭性抑制劑，當培養(yǎng)基中含有MTX時，二氫葉酸不能轉(zhuǎn)變成四氫葉酸而生長受到抑制。有一種突變的DHFR，它不受MTX

3、的抑制，以它作選擇標記，轉(zhuǎn)化的細胞可在含MTX的培養(yǎng)基上生長。選擇標記之二胸苷激酶基因tk－的宿主細胞在正常的培養(yǎng)基中可以生長，但在含有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸苷（T）的培養(yǎng)基中不能生長。這是因為氨基喋呤抑制了二氫葉酸還原酶的活性，導致細胞不能合成TTP。若將tk＋基因轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，雖然氨基喋呤抑制了核苷酸的從頭合成途徑，但培養(yǎng)基中的次黃嘌呤可以通過補救途徑轉(zhuǎn)變成ATP和GTP，胸苷通過胸苷激酶的作用可以轉(zhuǎn)變成TTP（CTP可以按正常途徑合成），所以被tk基因轉(zhuǎn)化了的細胞可

4、以在HAT培養(yǎng)基中生長。選擇標記之三新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neomycinphospho-transferaseⅡgene,nptⅡ）是一個來源于轉(zhuǎn)座子Tn5編碼的分子量為25KD的酶，它催化許多氨基糖苷類抗生素（如新霉素、慶大霉素、卡那霉素、G-418）的磷酸化反應，將ATP上的γ磷酸基團轉(zhuǎn)移到抗生素分子上，阻止了它們與靶位點——核糖體的相互作用，從而使這些抗生素失去對細胞的毒性。這類抗生素的毒理作用是與葉綠體及線粒體核糖體的30S亞基結(jié)合，阻止70S核糖體形成。選擇標記之四潮霉素

5、磷酸轉(zhuǎn)移酶基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（hygromycinphospho-transferase，HPT）可使潮霉素B磷酸化而失去毒性。潮霉素B可抑制核糖體的功能，使細胞不能合成蛋白質(zhì)，因此對大多數(shù)植物和動物細胞均有毒性。選擇標記之五氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因氯霉素能抑制真核細胞線粒體中的蛋白質(zhì)合成，而氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloramphenicolacetyltransferase，CAT）能使氯霉素乙酰化，從而失去毒性。選擇標記之六抗除草劑基因除草劑PPT是一種谷氨酸類似物，它競爭性地抑制植物體內(nèi)谷氨酰胺合成酶

6、（GS）的活性。谷氨酰胺合成酶催化下列反應，起到解氨毒的作用。當PPT存在時，GS活性被抑制，細胞內(nèi)NH4+積累，細胞中毒而死亡。選擇標記之六抗除草劑基因PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT）可以催化乙酰CoA分子上的乙?；D(zhuǎn)移到PPT分子的游離氨基上，乙酰化了的PPT失去對GS的抑制作用，從而使轉(zhuǎn)化了pat基因的植物表現(xiàn)出對PPT的抗性。用硅膠G薄層層析可以分離和分析乙?；腜PT，從而測定PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，所以pat基因也可以當作報告基因。報告基因報告基因（reportergene）可用于研究基因調(diào)控和轉(zhuǎn)

7、化基因的表達情況。報告基因一般是一種酶的基因，對報告基因的要求是在受體細胞中沒有其產(chǎn)物，產(chǎn)物容易檢測。報告基因之一β-葡糖醛酸糖苷酶基因β-葡糖醛酸糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）是目前應用最廣泛的報告基因之一。它以x-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖醛酸）為底物，催化產(chǎn)生藍色的5,5’-二溴-4,4’-二氯靛藍沉淀，可用來觀察轉(zhuǎn)化基因的組織化學定位。還可以4-MUG（4-甲基傘形酮葡糖苷酸）為底物，催化產(chǎn)生4-甲基傘形酮，產(chǎn)物用熒光分光光度計測定，此法可測定基因表達的強度。

8、報告基因之二氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因CAT也能用作報告基因。用14C標記的氯霉素、乙酰CoA與細胞、組織提取物反應，薄層層析法分離反應產(chǎn)物，放射自顯影可測得CAT活性。氯霉素的結(jié)構(gòu)式2,2-二氯-N-(1R,2R)-1,3二羥基-1-(4硝基苯基)丙-2-基乙酰胺氯霉素催化的反應及檢測方法報告基因之三熒光素酶基因熒光素酶（luciferase，LUX）基因取自熒火蟲或發(fā)光細菌，在ATP和Mg2+存在下，催化熒光素氧化發(fā)光?？捎冒l(fā)光光度計測定。