人巨細(xì)胞病毒pp65基因的原核表達(dá)及初步應(yīng)用

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1、夏宇人巨細(xì)胞病毒PP65基因的原核表達(dá)及初步應(yīng)用人巨細(xì)胞病毒PP65基因的原核表達(dá)及初步應(yīng)用摘要人巨細(xì)胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)是皰疹病毒科中最大的一種病毒。HCMV在人群中感染廣泛，在正常人群中通常造成無癥狀感染或持續(xù)感染，但在免疫缺陷患者中可引起嚴(yán)重后果。孕婦感染HCMV后，容易經(jīng)母嬰途徑傳播給胎兒，造成胎兒畸形、智力低下、神經(jīng)系統(tǒng)異常。因此孕婦的產(chǎn)前檢測意義重大。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是一種最常用的檢測HCMV抗體的方法。然而，大多ELISA商品試劑盒所用的是單表位的重組蛋白抗原。為提高HCMV抗體檢測的敏感性、特異性和

2、準(zhǔn)確性，推薦用雙表位或多表位的重組蛋白試劑盒來診斷HCMV感染。HCMV被膜磷蛋白pp65表明有T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。我們試圖通過基因重組技術(shù)制備HCMVpp65重組蛋白，并將其用作HCMV感染的診斷抗原。研究目的：通過基因重組制備HCMVpp65重組蛋白，并將其用于人巨細(xì)胞病毒感染的免疫學(xué)診斷?！芯糠椒ǎ焊鶕?jù)GenBank中公布的HCMVPP65基因序列，自行設(shè)計一對引物，PCR擴增目的基因片段，然后對純化的PCR產(chǎn)物及pGEX．4T-1載體質(zhì)粒用&D尺I和BamHI兩種限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切并純化回收，連接回收產(chǎn)物，構(gòu)建pGEX．4T-1

3、／PP65重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。將pGEX．4T-1／PP65重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌BL2l(DE3)，而后用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS．PAGE電泳檢測驗證其表達(dá)產(chǎn)物后，用親和層析技術(shù)對上清中的融合蛋白進(jìn)行純化，用ELISA間接法對已純化的GST／pp65融合蛋白的特性進(jìn)行鑒定。純化的GST／pp65用做ELISA診斷抗原檢測423例人血清，并與商品試劑盒做了比較。研究結(jié)果：通過PCR成功擴增PP65基因；成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX．4T-1／PP65；成功表達(dá)GST／pp65重組蛋白；GST／pp65重組蛋白與HCMV抗體結(jié)合的特

4、異性較好。研究結(jié)論：GST／pp65重組蛋白能用作HCMV診斷抗原。關(guān)鍵詞：人巨細(xì)胞病毒；GST／pp65重組蛋白；克隆；表達(dá)；純化；ELISA揚州大學(xué)碩士學(xué)位論文ProkaryoticexpressionandpreliminaryapplicationofhumanCVtOmegalOVlmSppO)geneinproKaryotlcsvstelTI·，■-一JLJL1—4’Abstract2一Humancytomegalovirus(HCMV)isthelargestmemberotthefamilyofhumanherpesviruses．Itisawides

5、preadpathogenwhichisresponsibleforgenerallyasymptomaticandpersistentinfectionsinhealthypeople．Howeveritmaycauseseverediseaseinimmunocompromisedindividuals．Iteasilyspreadsfrompregnantwomentotheirfetusthroughverticaltransmission，resultinginfetalmalformations，mentalretardationandnervoussys

6、temabnormalities．SoitisofgreatsignificancetoprenataldetectionofHCMVinfectioninpregnantwomen．Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)isamostcommonlyusedmethodofthedetectionofHCMVantibody．However,manycommercialELISAkitsbasedonrecombinantantigenprepared．Inordertoimprovethesensitivity,specifi

7、cityandaccuracyofHCMVantibodydetection，therecombinantproteinhadbeenrecommendedtoreplacethewhole-virusantigenfordiagnosingHCMVinfection．Themembranephosphoproteinpp65ofHCMVcontainTcellepitopesandBcellepitopes，whichCaninduceneutralizingantibodies．Therecombinantproteinpp65willbeexp