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《人巨細(xì)胞病毒pp65基因片段原核表達(dá)、鑒定以及酵母表達(dá)載體構(gòu)建》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、山西醫(yī)科大學(xué)磺士學(xué)位論文人巨細(xì)胞病毒pp65基因片段的原核表達(dá)、鑒定以及酵母表達(dá)載體的構(gòu)建摘要目的選擇HCMVpp65基因中能激發(fā)CTL和B細(xì)胞免疫的優(yōu)勢抗原表位基因pp65(1087—1515nt)基因片段，PCR擴(kuò)增片段，構(gòu)建表達(dá)載體并在原核細(xì)胞中進(jìn)行功能性表達(dá)，進(jìn)一步鑒定表達(dá)蛋白的抗原性；構(gòu)建酵母pPIC9K—pp65真核表達(dá)載體。方法參考pET-21a(+)載體序列多克隆位點，根據(jù)pp65(1087—1515nt)基因序列設(shè)計引物，堿性質(zhì)粒抽提法提取含有HCMVpp65全長基因的pGEM-T—pp65質(zhì)粒，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PcR)獲得目的pp65(10
2、87—1515nt)基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切、T4連接酶連接、藍(lán)白斑篩選構(gòu)建pET-21a(+)一pp65質(zhì)粒；經(jīng)酶切鑒定及核酸序列測定后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)；表達(dá)的蛋白進(jìn)行SDS—PAGE電泳并經(jīng)westernblot鑒定pp65融合蛋白的抗原性；包涵體蛋白經(jīng)過復(fù)性純化包被聚苯乙烯微量反應(yīng)板，ELISA法檢測pp65融合蛋白的抗原性。參考pPIC9K載體序列多克隆位點，根據(jù)pp65(1087—1515nt)基因序列設(shè)計引物，以pGEM-T—pp65質(zhì)粒為摸板，PCR獲得目的pp65(1087—1515nt)基因。PCR
3、產(chǎn)物與pMDl9一一Tsimple載體連接，藍(lán)白斑篩選構(gòu)建的pMDl9一一Tsimple—pp65質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測序鑒定后，以SnaBI和BlnI酶切pMDl9一simple—pp65質(zhì)粒和pPIC9K載體，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞。結(jié)果本研究克隆了HCMVpp65(1087—1515nt)基因，成功構(gòu)建了pET一21a(+)一pp65重組質(zhì)粒，獲得了穩(wěn)定表達(dá)pET一21a(+)一pp65的原核表達(dá)體系，westernblot和ELISA證實得到了具有抗原活性的ppG5融合蛋白片段：此外成功構(gòu)建了pPIC9K—pp65酵母表達(dá)載體。結(jié)論構(gòu)建了穩(wěn)定
4、的pET一21a(+)-pp65原核表達(dá)體系，獲得了具有活性、純度較高的pp65蛋白片段，此外也成功構(gòu)建了酵母表達(dá)載體pPIC9K—pp65，為大量制備活性pp65蛋白片段、HcMv感染檢測試劑的研發(fā)和HcM、，亞單位疫苗制備提供基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究pp65的生物學(xué)功能奠定實驗基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞巨細(xì)胞病毒，pp65蛋白，原核表達(dá)，變性，復(fù)性，Pichiapastods，pPIC9K山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文Prokaryoticexpression，identificationofhumancytomegaloviruspp65fragmentandestablishm
5、entofitseukarvoticpPIC9KexpressionvectorAbstractobjectiveToselectthepp65genefragmentcontainingthepredominanceepitopesandclonethepp65genefragment．Then,toconstructtheprokaryoticexpressionsystemforexpressingthepp65fragmentandidentifytheimmunologicalcharacteroftheexpressedprotein．Andalso
6、toestablishthepPIC9Keukaryoticexpressionvector．Methodspp65genewasamplifiedbyPCR．Theprimersweredesignedwiththemulti-clonesitesintheexpressionplasmidpET21a(+)andthepp65gene．ThetemplewaspGEM·T-pp65plasmidcontainingthetotalpp65gene．ThroughBamHIandXhoIdoubledigesting、T4ligaseligating、blue
7、-whitespotscreening，thepp65fragmentwassubelonedintothepET21a(+)expressionvectorsocalledpET-21a(+)·pp65．TheidentifiedpET-21a(+)一pp65wastmnsfectedintoE．coliBL21(DE3)．TheproteinWaspurifiedbyHis-tagnickelpostandidentifiedbywesternblottingandELISA．Thepp65geneWasamplifiedbyPCR．Theprimerswe
8、redesignedwi
