rn181在胃癌中表達及調(diào)節(jié)胃癌細胞增殖機制研究

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1、碩士學位論文刪RN181在胃癌中的表達及調(diào)節(jié)胃癌細胞增殖機制的研究碩士研究生：王小波指導(dǎo)教師：李明教授摘要背景：胃癌(GastricCarcinoma，GC)是人類常見的惡性腫瘤之一，在我國居惡性腫瘤之首。近年來，隨著診斷技術(shù)的進步及針對腫瘤的外科手術(shù)和放化療治療策略的成熟，胃癌的整體5年生存率有所提高，但術(shù)后胃癌的復(fù)發(fā)率仍居高不下，預(yù)后效果并不令人十分滿意。目前，大量的研究結(jié)果證實胃癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后是多基因、多因素及多階段改變的結(jié)果。所以研究胃癌相關(guān)基因及其蛋白分子不僅在了解胃癌的發(fā)病機制方面十分重要，而且在臨床靶向性治療和改善預(yù)后等方面也意義重大

2、。腫瘤細胞無限制的增殖多與細胞周期密切相關(guān)。細胞周期(cellcycle)是指連續(xù)分裂的細胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個過程，一般可分為：G0期(靜息期)、G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)、M期(有絲分裂期)；包含兩個主要檢驗點，即G1／S檢驗點(DNA合成起始轉(zhuǎn)換點)和G2／M檢驗點(有絲分裂誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換點)，通過檢驗點后，即使刺激信號被去除，細胞仍然會開始DNA復(fù)制。細胞周期是多階段、多因子參與的精確而有序的調(diào)控過程，可分為外源性和內(nèi)源性調(diào)控。外源性調(diào)控主要是由外界理化刺激引起；而內(nèi)源性調(diào)控

3、主要是通過對細胞周期蛋白(Cyclins)、細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin．dependentkinase，CDKs)、細胞周期依賴性激酶抑制因子(CDKinhibitors，CKIs)三者的調(diào)控來實現(xiàn)。眾所周知，摘要惡性腫瘤的明顯特點為細胞凋亡障礙和增殖失控，大量的研究表明細胞周期的失控與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系。所以研究腫瘤中細胞周期相關(guān)分子的變化有助于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制以及對臨床治療具有指導(dǎo)意義。人RNl81基因，又名HSPC238、RNFl81(ringfingerprotein181)，全長716個堿基，編碼153個氨基酸，因其第

4、40至60氨基酸殘基能夠形成特殊的RING指結(jié)構(gòu)域而得名。2008年Brophy等首次證實RNl81具有E3酶活性。本實驗室前期研究首次證實RNl81可以通過ERK／MAPK途徑抑制肝癌細胞HepG2、SMMC7721的生長。然而對于RNl81在其它腫瘤中的作用，以及調(diào)節(jié)腫瘤的具體作用機制仍是知之甚少。酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo．hybridsystem)是一種直接用于檢測細胞內(nèi)蛋一蛋白相互作用的具有高靈敏度且通用的實驗室方法，利用酵母體內(nèi)特殊的GAL4轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，把待檢測存在相互作用的兩個蛋白質(zhì)(X，Y)的編碼基因分別與GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)

5、域(DNA．bindingdomain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcriptionactivationdomain，AD)融合，通過下游報告基因的的篩選，得到存在相互作用的蛋白分子。所以，本實驗以臨床上高發(fā)的胃癌為研究對象，通過細胞學實驗、分子生物學實驗、酵母雙雜交等現(xiàn)代常用實驗技術(shù)，對RNl81在胃癌中的生物學功能以及在細胞周期方面的調(diào)節(jié)作用和具體機制進行研究。目的：1明確RNl81在臨床胃癌組織中的表達情況及其與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。2明確RNl81在胃癌細胞生長方面的具體生物學作用。3在體內(nèi)外闡明RNl81對胃癌細胞周期的影響及相關(guān)機制。4通

6、過酵母雙雜交實驗尋找與RNl81直接相互作用并參與細胞周期調(diào)節(jié)的分子。方法：1采用免疫組織化學染色的方法在165例臨床胃腺癌組織中，分析RNl81的表達量與臨床胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。2基于基因克隆技術(shù)，將pcDAN3．1(-)-flag／RNl81中的RNl81片段亞克隆碩士學位論文到逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝質(zhì)粒plncx2．GFP．IRES中，經(jīng)酶切、測序和Westernblot鑒定正確無誤后，與pVSV-G共轉(zhuǎn)染至GP2．293細胞中進行病毒包裝。將包裝的高表達逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胃癌AGS細胞，而后經(jīng)低濃度G418初步篩選；同時將購買的RNl81(上海吉瑪公司提供

7、)干擾慢病毒感染胃癌AGS、MKN28和MKN45三種細胞，經(jīng)流式分選得到帶綠色熒光的穩(wěn)定細胞系，通過RT-PCR、Westernblot鑒定后，擴大培養(yǎng)、凍存。3CCK．8法檢測穩(wěn)定高表達RNl81和穩(wěn)定干擾RNl8的重組細胞的增殖狀況，同時用平板克隆形成實驗檢測重組細胞的體外克隆形成能力，用裸鼠皮下接種成瘤的方法觀察重組細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。4采用細胞周期阻斷釋放法評價RNl81在AGS細胞中對細胞周期的影響，同時用Westernblot檢測周期蛋白CyclinD1，CyclinA，CyclinB相應(yīng)的變化。5Westernblot分析重組細胞在

8、G1／S和G2／M兩個周期檢驗點相關(guān)調(diào)節(jié)分子的變化，并用免疫組化的方法在裸鼠瘤體