轉(zhuǎn)gfp基因體細(xì)胞核移植克隆牛胚胎的研究

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1、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文轉(zhuǎn)GFP基因體細(xì)胞核移植克隆牛胚胎的研究姓名：鄧守龍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：動(dòng)物遺傳育種與繁殖指導(dǎo)教師：王安江;余雄20090601轉(zhuǎn)GFP基因體細(xì)胞核移植克隆牛胚胎的研究摘要本文對(duì)提高轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植克隆牛早期胚胎發(fā)育進(jìn)行了研究，目的是為了優(yōu)化體細(xì)胞核移植法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆牛胚胎，以克服重構(gòu)胚胎發(fā)育阻斷，為提高體外克隆轉(zhuǎn)基因胚胎的質(zhì)量和數(shù)量提供理論基礎(chǔ)。本論文設(shè)計(jì)了五個(gè)試驗(yàn)，分別為：試驗(yàn)一探討了HYA(透明質(zhì)酸酶)的濃度和作用時(shí)間對(duì)牛體外成熟卵母細(xì)胞脫卵丘及電激活參數(shù)對(duì)牛孤雌胚胎的影響；試驗(yàn)二試驗(yàn)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法與電穿孔法，以攜帶綠色熒光蛋白(GFP)．新霉素

2、抗性(neo．)雙標(biāo)記基因的PMScV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胎牛耳成纖維細(xì)胞為供體與體外成熟的牛卵母細(xì)胞為受體構(gòu)建克隆胚，研究不同轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建供體細(xì)胞對(duì)重構(gòu)胚發(fā)育的影響，并研究供體細(xì)胞的傳代次數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚的影響；試驗(yàn)三卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度的EGF對(duì)轉(zhuǎn)基因核移植胚胎的發(fā)育影響；試驗(yàn)四不同強(qiáng)度的電脈沖+乙醇+6．DMAP對(duì)牛轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚的融合和激活，電融合液中鈣離子濃度對(duì)融合效果的影響；實(shí)驗(yàn)五利用以上優(yōu)化方案生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆胚胎，研究轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚在不同體外發(fā)育培養(yǎng)系統(tǒng)與培養(yǎng)體系中的發(fā)育效果。試驗(yàn)結(jié)果如下：1．體外成熟培養(yǎng)液中添加EGF30ng／mL組卵母細(xì)胞成熟率最高，對(duì)轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚的囊胚

3、發(fā)育率，以添加EGF20ng／mL組最高。2．不同轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染供體細(xì)胞構(gòu)建重構(gòu)胚，其囊胚發(fā)育率差異不顯著(尸>O．05)，但脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法效果較好。3．傳代5次的胎牛耳成纖維細(xì)胞做核供體，較有利于轉(zhuǎn)基因胚的發(fā)育。4．卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)22h，用0．20％HYA作用10min與0．50％HYA作用5min脫卵丘差異不顯著(尸>O．05)，優(yōu)于其他試驗(yàn)組。5．在激活電壓1．6kV／cm、201．ts／次、間隔ls，脈沖次數(shù)為單次的條件下的激活效果較好。6．應(yīng)用到體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚的融合上得到相同結(jié)果，電融合液中鈣離子濃度為lmmol／L，囊胚率最高。7．mSOFaa+顆粒細(xì)胞單層細(xì)胞共培養(yǎng)體系

4、中的轉(zhuǎn)基因囊胚發(fā)育率最好。8．負(fù)壓?jiǎn)螌宇w粒細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的轉(zhuǎn)基因囊胚發(fā)育率較好。關(guān)鍵詞：牛，轉(zhuǎn)GFP基因，孤雌，核移植，體外發(fā)育StudyonTransgenicGFPGeneinBovineEmbryosProductionbySomaticCellNuclearTransferAbstractThisstudywastooptimizeasystemforproductionoftransgenicbovineembryosbynucleartransferofsomaticcells．Firstpurposeistoconfirmtheeffectthatsomaticcell

5、nucleartransferWasusedatthefield．Secondpurposeistocheckoutblastularatioofsomaticcellnucleartransfer．AndthirdpurposeistoimprovetheenvironmentsoftransgenicbovineembryosandprovidetheoreticbasisoftransgenicbovineembryosqualityandquantityforIVC．ApmScvwithgreenfluorescentprotein-mycophenolateresistanc

6、emarkergenewastransfectedintofetmfibroblastcellsthatWasthedonor．ThematurationofbovineoocyteinvitroWasthereceptor．TheembryocloningWasconstructedbythedonorandreceptor．TheexperimentWastoexamineresearchfuleffectwhichbovineembryoswereproducedwitllParthenogenesisinvitro，Wastoexamineresearchfialeffecto

7、fHYA，differenttimeandconcentrationofoocyteinteractioninvitro．PMs“containingGFPandneo．geneWastransfectedintothecattlefetalaurisfibroblastcellswhichwasthedonorbylipofectionorelectrofusion．ThematurationofbovineoocyteinvitroWasr