轉(zhuǎn)人溶菌酶基因核移植克隆胚的發(fā)育研究

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1、西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文轉(zhuǎn)人溶菌酶基因核移植克隆胚的發(fā)育研究姓名：賈淑玲申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：發(fā)育生物學(xué)指導(dǎo)教師：張涌20080501轉(zhuǎn)人溶菌酶基因核移植克隆胚的發(fā)育研究摘要人溶茵酶作為一種天然蛋白質(zhì)，由于其具有抗菌消炎、防腐保鮮的功能，被廣泛地應(yīng)用于人們地生產(chǎn)生活中，但是從人體組織、器官中提取的人溶菌酶遠遠不能夠滿足人們的需要。因此，近年來，人們把目光投向了當(dāng)前的基因工程技術(shù)，即利用原核或真核生物作為寄主細胞，來實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)人溶菌酶的目的。在此基礎(chǔ)上，乳腺生物反應(yīng)器的研究成為了當(dāng)前生物技術(shù)領(lǐng)域的熱點之一，而利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)生

2、物活性蛋白的研究也迅速展開。本實驗的目的在于為乳腺生物反應(yīng)器提供轉(zhuǎn)基因供體細胞，在以前的實驗基礎(chǔ)上，進行了以下研究工作：1．采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)了牛耳皮膚成纖維細胞，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染第四代成纖維細胞，載體為含綠色熒光蛋白和G418抗性基因雙重篩選標(biāo)記的人溶菌酶乳腺特異性表達載體pEBH。利用PCR和ImPCR的方法鑒定了轉(zhuǎn)基因陽性成纖維細胞中目的基因的表達，結(jié)果得到了陽性條帶。說明此次轉(zhuǎn)基因細胞可以作為轉(zhuǎn)基因動物供體細胞。2．將以上轉(zhuǎn)基因細胞用于核移植時，為了說明轉(zhuǎn)基因細胞對核移植后的重構(gòu)胚的發(fā)育影響，設(shè)計了不同的實驗，得到了以下結(jié)果：

3、(1)研究了基因轉(zhuǎn)染對重構(gòu)胚發(fā)育的影響。實驗組以G418篩選4周的轉(zhuǎn)基因細胞為供體細胞進行核移植，對照組為非轉(zhuǎn)基因細胞。發(fā)現(xiàn)實驗組重構(gòu)胚與對照組相比，融合率，卵裂率沒有顯著差異，但囊胚發(fā)育率轉(zhuǎn)基因組顯著低于對照組(P<0．05)，這說明基因轉(zhuǎn)染及篩選過程對轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚的發(fā)育有不利的影響。(2)比較不同的轉(zhuǎn)基因細胞挑選方法對轉(zhuǎn)基因克隆胚發(fā)育及陽性率的影響。轉(zhuǎn)染一周后發(fā)熒光的轉(zhuǎn)基因細胞、篩選一個月細胞、篩選一月后發(fā)熒光的細胞用于核移植，三組細胞在融合率及卵裂率沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異，但對囊胚發(fā)育率及轉(zhuǎn)基因囊胚陽性率有顯著的影響。P

4、)研究了綠色熒光蛋白在重構(gòu)胚中的表達時問及其對胚胎后期發(fā)育的影響。8．16細胞開始表達熒光蛋白的重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育最高。關(guān)鍵詞：牛；人溶菌酶；轉(zhuǎn)基因；體細胞核移植；胚胎DEVELOP衛(wèi)衄NTSTUDIESONNUCLEARTRANSFEREMBRYOSTRANSFECTEDHI】-MANIjYSOZYMEABSTRACTThestlldyofm鋤ma巧酉aIldbioreactorhasbecomeoneofthehotspotsinthebiotec：hn0109yfield，andtheresearchonproductionofp∞te

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7、maticcellnuclear劬msf．er．F0110wingresultshavebeeIlobtained：1．Bovine舶roblastcellswereisolatedbyattachingtissueeXplants舶mearsl(inofabovine．TheplasmidpEBHcontaininggeneofhIjyZandtwoselectingmarks(theEGFPandNeorgene)whichexpressspecificallyinm鋤mary91andwastransfectedby1ipof．ect

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