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1、改進(jìn)的核移植方法完成小鼠卵丘細(xì)胞重組胚的早期發(fā)育作者：沈新明1,2；喬貴林1；江培洲1；李欣1；黃華1；姚開(kāi)泰1 (1南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，廣東??廣州??510515，2上海市東方肝膽外科醫(yī)院，上海??200438)摘要：目的??建立一種快速、簡(jiǎn)便、有效且損傷小的核移植方法，研究來(lái)源于小鼠體細(xì)胞重組胚的早期發(fā)育。方法??用尖銳的去核針在MⅡ期卵母細(xì)胞透明帶上切開(kāi)一個(gè)25mm左右的小口，首先將第一極體挑出，再輕輕地?cái)D壓和負(fù)壓吸引卵母細(xì)胞，去除包含有MⅡ期染色體-紡錘體復(fù)合體的最少量細(xì)胞質(zhì)。隨后，將直徑為10~12m
2、m的C57BL/6j小鼠卵丘細(xì)胞核注射到去核卵母細(xì)胞透明帶下，構(gòu)建供體核-卵母細(xì)胞復(fù)合體。用電融合的方法誘導(dǎo)復(fù)合體融合，并對(duì)重組胚激活。體外培養(yǎng)72h，對(duì)重組胚發(fā)育到2細(xì)胞、4~8細(xì)胞和桑椹胚期等各階段進(jìn)行觀(guān)察和計(jì)數(shù)。結(jié)果??完成一個(gè)MⅡ期卵母細(xì)胞去核的平均時(shí)間為15s；Hoechst33342染色證明可以完全去除MⅡ期卵母細(xì)胞細(xì)胞核；去核成功率為95.5%，注核成功率為76.7%，供體核-卵母細(xì)胞復(fù)合體融合和重組胚原核形成率分別為68.2%和62.2%；重組胚體外培養(yǎng)72h內(nèi)發(fā)育到2細(xì)胞、4~8細(xì)胞和桑椹胚期的比率分
3、別為57.5%、39.1%和27.6%；用2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)D7Mit22和D4Mit204引物，擴(kuò)增不同發(fā)育階段重組胚的DNA片段，表明重組胚來(lái)源于供體卵丘細(xì)胞。結(jié)論??應(yīng)用改進(jìn)的核移植方法，不僅可以有效地去除卵母細(xì)胞細(xì)胞核，去核成功率高，而且操作簡(jiǎn)便，去核迅速，對(duì)卵母細(xì)胞損傷小，是研究小鼠體細(xì)胞核移植的一種簡(jiǎn)便可行的新方法。關(guān)鍵詞：細(xì)胞核/移植；電融合；卵母細(xì)胞；重組胚中圖分類(lèi)號(hào)：R329.25??文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??文章編號(hào)：1000-2588(2005)06-0613-06Amodifiedmethodofnucle
4、artransferforinvestigatingearlydevelopmentofmouseembryosreconstructedwithcumuluscellnucleiSHENXin-ming1,2；QIAOGui-lin1；JIANGPei-zhou1；LIXin1；HUANGHua1；YAOKai-tai11InstituteofCancerResearch,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2EasternHepatobiliaryHosp
5、ital,Shanghai200438,ChinaAbstract:ObjectiveToestablishafast,simple,efficientandminimallyinvasivemethodfornucleartransfer(NT)tostudytheearlydevelopmentofmouseembryosreconstructedwithcumuluscellnucleiinvitro.MethodsWithasharp-tippedenucleationneedle,anincisionappr
6、oximately25mminlengthwasmadeinthezonapellucidaofaratoocyte,throughwhichthefirstpolarbodywasremovedandthemetaphaseⅡchromosome-spindlecomplexwasgentlyaspiratedalongwithaminimalvolumeofthecytoplasmbyslightlypressingandvacuumaspirationoftheoocyte.Acumuluscellnucleif
7、romC57BL/6jmouse,10-12mmindiameter,wasinsertedintotheperivitellinespaceoftheenucleatedoocyte.Thefusionofthedonor-recipientpairwasinducedbyelectrofusionandnuclearformationwasobserved.Thedevelopmentof2-cell,4-to8-cellandmorula-stageembryoswasobservedaftera72-hourc
8、ultureofthereconstructedoocytesinvitro.ResultsThemodifiedNTmethodenabledone-stepremovalofthewholenucleusfromtheoocytewithconfirmedreliabilityofcompletenuclearremovalb
