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1、AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI碩士學(xué)位（畢業(yè)）論文Zebularine對綿羊卵丘細(xì)胞及其核移植胚胎發(fā)育效果的影響研究學(xué)位申請人：蘇文龍指導(dǎo)教師：李俊杰教授學(xué)科專業(yè)：動物遺傳育種與繁殖學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二?一五年五月三十日獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研艽成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不句.食為獲得河北農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所
2、做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說明并表不謝意。學(xué)位論文作者簽名：省令/l^簽字日期=年〈月In學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書卞學(xué)位沁寸怍老嘗仝了解河北農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。太人捋權(quán)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書）學(xué)位論文作者簽名：免AJL導(dǎo)師簽仏T^/6月7簽字R期：年月I曰簽字円期：如/《年學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位：通訊地址：分
3、類號：S814.8單位代碼：10086密級：公開學(xué)號：2012336Zebularine對綿羊卵丘細(xì)胞及其核移植胚胎發(fā)育效果的影響研究StudyontheEffectofZebularineonCumulusCellsandDevelopmentofSomaticCellNuclearTansferEmbryos學(xué)位申請人：蘇文龍指導(dǎo)教師：李俊杰教授學(xué)科專業(yè)：動物遺傳育種與繁殖學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二〇一五年五月三十日試驗所屬項目及資金來源本研究由河北省自然科學(xué)基金項目（C2014204119）和河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研
4、究重點項目（ZD2014002）項目資助。摘要體細(xì)胞核移植技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個研究領(lǐng)域具有越來越重要的意義，但核移植效率低限制了其發(fā)展。目前研究人員普遍認(rèn)為，核移植效率低主要是由于供體細(xì)胞核在卵母細(xì)胞中的重編程不完全造成的。而供體細(xì)胞DNA甲基化重編程異常是主要原因之一。本研究以綿羊卵丘細(xì)胞為供體細(xì)胞，擬通過添加DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑Zebularine，探討其對綿羊卵丘細(xì)胞生物學(xué)特性、核移植重構(gòu)胚發(fā)育及對胚胎甲基化水平的影響，嘗試建立一種既不影響體細(xì)胞生物學(xué)特性，又可降低供體細(xì)胞細(xì)胞核的甲基化狀態(tài)方法，從而提供一種提高體細(xì)胞核移植效率的有效途
5、徑。試驗中使用不同濃度（0、2.5、5、10nmol/L）的Zebularine處理綿羊卵丘細(xì)胞12h，研究不同處理對綿羊卵丘細(xì)胞的存活率、染色體倍性、細(xì)胞周期、DNA甲基化水平、DNMT1基因表達(dá)水平、核移植胚胎發(fā)育能力的影響。同時，使用間接免疫熒光染色法檢測了5nmol/LZebularine處理綿羊卵丘細(xì)胞12h后對核移植胚胎不同發(fā)育時期DNA甲基化水平的影響。結(jié)果顯示：（1）經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑Zebularine（2.5-10nmol/L）處理后的卵丘細(xì)胞存活率與未經(jīng)過處理的對照組相比沒有顯著差異（P>0.05）；（2）采用常規(guī)染色體核型分
6、析發(fā)現(xiàn)，不同濃度Zebularine處理組與對照組的細(xì)胞染色體整二倍體比例（96.11%、96.53%、95.13%、96.77%）均沒有顯著差異（P>0.05）；（3）通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，結(jié)果顯示：綿羊卵丘細(xì)胞經(jīng)不同濃度Zebularine處理12h后，G0/G1的細(xì)胞比例呈逐漸上升趨勢，S期細(xì)胞比例均呈逐漸下降的趨勢，但與對照組之間均沒有顯著差異（P>0.05）；（4）使用間接免疫熒光染色法檢測DNA甲基化水平，卵丘細(xì)胞DNA甲基化水平隨著Zebularine處理濃度的升高而降低，其中5、10nmol/L處理組DNA甲基化水平顯著顯著低
7、于對照組（P<0.05），但兩處理組間沒有顯著差異（P>0.05）；（5）通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)：卵丘中Dnmt1基因表達(dá)水平隨著Zebularine處理濃度的升高而降低，其中5、10nmol/L處理組Dnmt1基因表達(dá)水平顯著低于對照組（P<0.05），且10nmol/L處理組顯著低于5nmol/L處理組（P<0.05）；（6）綿羊卵丘細(xì)胞經(jīng)不同濃度Zebularine處理12h后進行核移植，結(jié)果顯示：Zebularine各處理組與對照組（0nmol/L）間核移植胚胎的卵裂率差異均不顯著（P>0.05）；5nmol/LZebularine
8、處理組桑椹胚率顯著高于對照組（P<0.05），與其他各組間差異不顯著（P>0.05）。5nmol/LZebularine處
