生長(zhǎng)分化因子-9對(duì)牛卵丘細(xì)胞影響的研究

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1、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)聲明本人申明所呈交的學(xué)位論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包括其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包括為獲得我校或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料，與我～同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名：迭罌絲熟蝣臣、盡期：巡f堡：笸：qI{內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本人完全了解內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)太學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)

2、的規(guī)定，即：研究生在攻讀學(xué)位期閭論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，且導(dǎo)師為通訊作者，通訊作者單位亦署名為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子文檔，允許論文被查閱和借閱。學(xué)校可以公布學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容(保密內(nèi)容除外)，采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：日期：本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金(31060307)國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2011BADl9801)lIIIIIIIUIIIIIY2600

3、726公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(201003061)提供資助ThiSd’issertationwassupportedbyTheNationaINaturaIScienceFoundationofchina(31060307)TheNationa{KeyTechnoIogyR&DProgram(2011BADl9801)TheSpeciaIFundforAgro-scientif；CResearchinthePubIicInterest(201003061)摘要本論文研究了重組GDF-9對(duì)牛卵丘細(xì)胞增殖及擴(kuò)展相關(guān)基因表達(dá)

4、的影響。研究結(jié)果分如下4個(gè)部分：1．通過(guò)RT—PCR檢測(cè)體外培養(yǎng)不同成熟時(shí)間的牛卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體中GDF-9的表達(dá)情況，同時(shí)觀察卵丘擴(kuò)展情況。結(jié)果表明在不同的成熟培養(yǎng)時(shí)間，GDF-9基因在牛卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體中均有表達(dá)，且在體外成熟培養(yǎng)12小時(shí)表達(dá)量成峰值，與卵丘細(xì)胞開(kāi)始擴(kuò)展的時(shí)間一致。2．將卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體中的卵母細(xì)胞進(jìn)行去除處理，同時(shí)加入外源lOOng／mlGDF一9以及1OugFSH，觀察外源GDF一9和內(nèi)源的GDF一9對(duì)卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞復(fù)合體在體外培養(yǎng)中擴(kuò)展的影響。結(jié)果表明不論外源GDF一9和內(nèi)源的GDF一9在卵

5、丘細(xì)胞擴(kuò)展中都起著重要的作用，而且FSH對(duì)卵丘細(xì)胞的作用也需要．GDF一9的協(xié)同。3．在牛卵丘細(xì)胞體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，研究外源GDF-9和FSH對(duì)其生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，不論FSH存在與否，GDF一9可以促進(jìn)牛卵丘細(xì)胞增殖．這種促進(jìn)作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)。而且在相同GDF一9濃度下，F(xiàn)SH顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，表明GDF一9與FSH在一定程度上對(duì)卵丘細(xì)胞的增殖具有協(xié)同作用。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究不同濃度下外源重組6DF一9對(duì)牛卵丘細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)基因(PTX3、HAS2、PTGS2)表達(dá)的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明：擴(kuò)展相關(guān)基醫(yī)表達(dá)對(duì)

6、GDF-9濃度具有梯度依賴性，隨著GDF一9濃度的增大，擴(kuò)展相關(guān)基因表達(dá)也隨著增大，表明GDF-9在卵丘細(xì)胞擴(kuò)展中起到一定的作用。4．構(gòu)建牛GDF一9基因真核表達(dá)質(zhì)粒，在牛卵丘細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。利用western—blot檢測(cè)GDF一9在卵丘細(xì)胞中過(guò)表達(dá)情況，同時(shí)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)展相關(guān)基因表達(dá)的情況。(1)通過(guò)weste]1n—blot對(duì)牛GDF一9過(guò)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明，檢測(cè)有單一條帶，說(shuō)明GDF一9真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。(2)與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)GDF一9的牛卵丘細(xì)胞中擴(kuò)展相關(guān)基因的表達(dá)明顯升高。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)GDF

7、一9在卵丘細(xì)胞體外增殖培養(yǎng)中的作用研究，表明GDF一9對(duì)卵丘細(xì)胞增殖具有重要作用，這一結(jié)-步闡明GDF-9調(diào)節(jié)卵丘細(xì)胞功能的分子機(jī)制具有重要的意義。關(guān)鍵詞：生長(zhǎng)分化因子9；牛卵丘細(xì)胞：擴(kuò)展相關(guān)基因TheStudyonGrowthDifferentiationFactor9AffectingCumulusCellAbstractRecombinantGDF一9affectingthebovinecumuluscellsproliferationandtheexpressionoftherelategeneswereinvesti

8、gatedinthisthesis．theresultareasfollow：1．TheGDF-9expressioninthebovinecumulusoocytecomplexesatthedifferentmatureculturetimeweremeasuredbyu