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1、分類號(hào)S852.1學(xué)校代碼10129UDC577學(xué)號(hào)2010301018Ghrelin對(duì)體外牛卵丘細(xì)胞增殖和卵母細(xì)胞成熟影響的研究EffectsofGhrelinontheBovineCumulusProliferationandOocytesMaturationinVitro申請(qǐng)人：米焱學(xué)科門(mén)類：農(nóng)學(xué)學(xué)科專業(yè)：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究方向：動(dòng)物組織胚胎與發(fā)育生物學(xué)指導(dǎo)教師：曹貴方教授李海軍副教授論文提交日期：二〇一三年六月摘要哺乳動(dòng)物中，Ghrelin被發(fā)現(xiàn)是一種協(xié)調(diào)能量和生殖活動(dòng)平衡的促進(jìn)食欲的胃腸激素，是生長(zhǎng)激素促分泌物受體（
2、Growthhormonesecretagoguereceptor，GHS-R）的內(nèi)源性配體，主要在胃組織內(nèi)分泌細(xì)胞中分布。近年，在生殖系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)Ghrelin的高表達(dá)，有力的證明Ghrelin在生殖系統(tǒng)中有著比較重要的位置。卵母細(xì)胞的成熟與發(fā)育是哺乳動(dòng)物進(jìn)行體外受精及胚胎發(fā)育的先決條件，但是，卵母細(xì)胞成熟過(guò)程受到多重因素的影響。Ghrelin作為近年發(fā)現(xiàn)的新型激素，在一定程度上影響著生殖系統(tǒng)。因此，探索Ghrelin在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的潛在作用對(duì)于促進(jìn)體外受精等相關(guān)胚胎工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用有著重要的理論與實(shí)踐指導(dǎo)意義。
3、研究表明Ghrelin和GHS-R主要在卵巢具有分泌類固醇的黃體細(xì)胞和間隙細(xì)胞中表達(dá)，在卵母細(xì)胞中也有Ghrelin和其受體的表達(dá)。而且Ghrelin在體外刺激顆粒細(xì)胞增殖和抑制其凋亡而促進(jìn)卵泡發(fā)育，并且抑制卵母細(xì)胞成熟。Ghrelin是否參與牛卵母細(xì)胞成熟，是否可以促進(jìn)牛卵丘細(xì)胞增殖，未見(jiàn)報(bào)道。本研究以牛卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）為研究對(duì)象，運(yùn)用免疫熒光染色和激光共聚焦掃描技術(shù)、熒光定量RT-PCR、細(xì)胞增殖活性檢測(cè)和WesternBlotting等方法對(duì)體外成熟過(guò)程中Ghrelin和GHS-R1a在牛卵母細(xì)胞和卵丘
4、細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行研3究，并在體外培養(yǎng)條件下，添加Ghrelin和其受體抑制劑（[D-Lys]-GHRP-6），觀察其對(duì)卵母細(xì)胞成熟和卵丘細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果如下：1.Ghrelin蛋白在牛卵母細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，而GHS-R蛋白則特異性的定位于卵母細(xì)胞膜表面，在卵丘細(xì)胞中均有Ghrelin和GHS-R蛋白表達(dá)。2.體外成熟過(guò)程中卵母細(xì)胞Ghrelin和GHS-R1amRNA相對(duì)表達(dá)量隨著成熟進(jìn)程顯著下降；卵丘細(xì)胞中，GhrelinmRNA表達(dá)量隨著成熟時(shí)間在8h顯著增加然后在16h顯著下降，而GHS-R1amRNA表達(dá)量隨
5、著成熟時(shí)間逐漸增加。3.FSH抑制卵母細(xì)胞Ghrelin和GHS-R1amRNA表達(dá)，而FSH顯著促進(jìn)卵丘細(xì)胞Ghrelin和GHS-R1amRNA表達(dá)；FSHBI解除FSH對(duì)卵母細(xì)胞Ghrelin和GHS-R1amRNA表達(dá)的抑制作用和FSH對(duì)卵丘細(xì)胞Ghrelin和GHS-R1amRNA表達(dá)的促進(jìn)作用。4.Ghrelin和FSH顯著促進(jìn)卵丘細(xì)胞表達(dá)PCNA和BCL-2mRNA，而3[D-Lys]-GHRP-6的添加促使PCNA和BCL-2mRNA水平顯著降低（P<0.05）；3[D-Lys]-GHRP-6和FSH對(duì)凋亡
6、基因BAXmRNA的表達(dá)無(wú)作用，Ghrelin顯著抑3制BAXmRNA的表達(dá)，[D-Lys]-GHRP-6解除Ghrelin對(duì)BAX表達(dá)的抑制作用（P<0.05）。35.Ghrelin刺激卵丘細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)，而[D-Lys]-GHRP-6抑制Ghrelin對(duì)PCNA表達(dá)的促進(jìn)作用。36.Ghrelin和FSH明顯促進(jìn)卵丘細(xì)胞增殖活性，[D-Lys]-GHRP-6抑制卵丘3細(xì)胞活性增加（P<0.05），而且[D-Lys]-GHRP-6抑制Ghrelin和FSH促進(jìn)卵丘細(xì)胞增殖活性的增加。7.Ghrelin抑制卵母細(xì)胞B
7、MP15和GDF9mRNA表達(dá)，以及卵母細(xì)胞GVBD3發(fā)生率，而這種作用被[D-Lys]-GHRP-6解除。關(guān)鍵詞：牛；卵母細(xì)胞；卵丘細(xì)胞；免疫熒光染色；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR；細(xì)胞增殖活性；Westernblotting；GVBDEffectsofGhrelinonBovineCumulusProliferationandOocyteMaturationinvitroAbstractGhrelinistheorexigenicguthormonethathasbeenputforwardtoregulatethebal
8、ancebetweenenergyandreproductioninmammals,andistheendogenousligandofgrowthhormonesecretionreceptor(GHS-R),distributioninendocrinecellsofgastrictissue.In
