豬卵丘細(xì)胞核移植研究

《豬卵丘細(xì)胞核移植研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。

1、動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展.2005,26(7):64-68ProgressinVeterinaryMedicine豬卵丘細(xì)胞核移植研究項(xiàng)智鋒I,謝紅兵I,張金洲王清華I,張德福2?（1?河南科技學(xué)院動(dòng)科系，河南新鄉(xiāng)453OO3M.上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，上海201106）中BB分類號(hào)：S813.2文Itt標(biāo)識(shí)碼：A文章第號(hào):1007-5038(2005)07-0064-05播要：以卵丘細(xì)胞為供核體細(xì)胞，采用胞質(zhì)內(nèi)注射法進(jìn)行豬體細(xì)胞核移植，對(duì)去核、激活?和培養(yǎng)等關(guān)鍵技術(shù)過程進(jìn)行研究，結(jié)果表明，①點(diǎn)壓法、擠壓法對(duì)卵母細(xì)胞去核率明顯高于盲吸法（三者分別為62.5%,64.6%,50.7%,

2、PV0.05）。盲吸法去核染色體容易發(fā)生位置偏離，彩響去核效果，但對(duì)早成熟的卵母細(xì)胞（36h?44h）進(jìn)行去核可明顯提高去核效率（PV0?05）,在成熟培養(yǎng)36h?38h、39h?41h、42h?44h去核率分別為60?9%、67.8%、64?3%,而45h?48h為4&4%。②體細(xì)胞預(yù)激活有助于提高核移胚卵裂率（2&0%,20.1%,PV0?05）。A23187（Ca2+ionophore,鈣離子栽體）單獨(dú)或與6-DMAP（6-Dimethylaminopurine,6-二甲基氨基喋冷）聯(lián)合作用能使豬體細(xì)胞核移胚激活繼續(xù)發(fā)育。③核移胚以胚胎培養(yǎng)液“。SU-23（North

3、CarolinaStateUniversity-23medium,北卡洲立大學(xué)培養(yǎng)液-23）及卵丘顆粒單層共培養(yǎng)體系進(jìn)行分別培養(yǎng)，核移胚卵裂率無明顯差異（30.06%,31.5%,P>0.05）。但NCSU23培養(yǎng)4細(xì)胞后發(fā)育能力更高（13.5%,3.9%,P<0.05）o關(guān)鍵詞：核移植；體細(xì)胞；去核；激活哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)是目前生物技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一，核移植為畜牧業(yè)及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)帶來廣闊的應(yīng)用前景，目前已在牛、豬和山羊等家畜獲得了體細(xì)胞核移植后代。與牛、山羊、綿羊等家畜相比，豬體細(xì)胞核移植因?yàn)榉N屬特異性研究困難最大。僅有的幾例報(bào)道中，成功率也相對(duì)較低，說明許多環(huán)節(jié)

4、需要繼續(xù)研究，而轉(zhuǎn)基因豬用于異種移植解決人類移植器宮供求矛盾，使克隆豬較其他克隆物種具有特別的意義。對(duì)奶牛、小鼠和山羊的研究表明，以卵丘細(xì)胞作為核供體所組成的重構(gòu)胚比成纖維細(xì)胞重構(gòu)胚有更高的卵裂率和囊胚發(fā)育率。本文以卵丘細(xì)胞為供核體細(xì)胞，采用胞質(zhì)內(nèi)注射法進(jìn)行豬體細(xì)胞核移植，對(duì)其中一些技術(shù)環(huán)節(jié)如去核、激活和培養(yǎng)等過程的相關(guān)作用和影響因素進(jìn)行研究。但核移植技術(shù)是一項(xiàng)復(fù)雜的技術(shù),核移植的總體效率低，這與核移植技術(shù)環(huán)節(jié)的復(fù)雜性（包括受體細(xì)胞培養(yǎng)、去核、激活、供體細(xì)胞選擇、注核、重構(gòu)胚培養(yǎng)發(fā)育）與目前對(duì)重構(gòu)胚重編程機(jī)理及核質(zhì)互作的詳細(xì)機(jī)制了解不夠相關(guān)。1材料與方法1.1受體卵母細(xì)胞的

5、雇備取屠宰場屠宰的豬卵巢，注射器采集卵巢表面直徑為2mm~6mm卵泡內(nèi)容物，體視顯微鏡下檢取卵丘~卵母細(xì)胞復(fù)合體（Complexofoocte-cumu-lus,COCs）,39€、體積分?jǐn)?shù)為5%CO?和憾和濕度下體外成熟培養(yǎng)(培養(yǎng)液:TCM199+100mL/LNCS十10%豬卵泡液+10IU/mLPMSG+10IU/mLhCG+0?57mmol/LL-Cys+200單位/mL青鏈番素+lmg/LE2)獲得MU期卵母細(xì)胞。挑選排出第一極體或一側(cè)卵周隙擴(kuò)大的卵母細(xì)胞移到含5Mg/mL細(xì)胞松弛素B的TCM199+100mL/NCS中，37"C溫育15min,將含有卵母細(xì)胞的凹

6、玻片放在顯微操作系統(tǒng)（Leitz）的載物臺(tái)上。調(diào)節(jié)顯微操作儀的操作桿，使固定管和尖瑞去核管與卵母細(xì)胞處于同一平面上。1.2去核挑選體外培養(yǎng)成熟36h?48h卵母細(xì)胞，以下面3種方法在Leica顯微操作系統(tǒng)上進(jìn)行去核操作。收稿日期:2005-01-04墓金項(xiàng)目：河南科技學(xué)院青年基金項(xiàng)目作者介：項(xiàng)智鋒（1978-）,M,湖北黃岡人，碩士?講殍，主矣從豐動(dòng)竹胚胎工程的研丸?*am作者方法1為盲吸法.用固定管固定卵母細(xì)胞，使第一極體位于固定管的對(duì)側(cè)，用直徑25“n?35Mm的去核針尖端頂穿透明帶，在第一極體附近吸取第一極體及其下方胞質(zhì)。去核后再用10pg/mLHoe-hchst33

7、342染色10min,于熒光顯微鏡下觀察去核率。方法2為擠壓法。用固定管固定卵母細(xì)胞，使第一極體位于固定管的上方或下方(即時(shí)鐘的12點(diǎn)或6點(diǎn)處)。將拉針儀上未經(jīng)斷口的玻璃針尖端在第一極體兩側(cè)1/5?1/4卵周長處挑開透明帶并在固定管上輕摩，在透明帶上形成1/5?1/4卵周長的切口。然后用鈍端輔助去核管在透明帶切口的斜下方輕擠卵母細(xì)胞，使第一極體連同其附近的1/4?1/3胞質(zhì)溢出透明帶，去核后再用10Mg/mLHoce-hest33342染色10min,于熒光顯微鏡下觀察去核率。方法3為點(diǎn)壓法。用固定管固定卵母細(xì)胞，