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1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文改良骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法姓名：刁玉佩申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：耳鼻咽喉科學(xué)指導(dǎo)教師：董明敏201203中文摘要改良骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法碩士研究生：導(dǎo)師：鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院刁玉佩董明敏鄭州450001骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymalstemcells，BMSCs)也稱骨髓基質(zhì)來源干細(xì)胞，是存在于骨髓中除造血干細(xì)胞以外另一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞。在一定誘導(dǎo)條件下，這類細(xì)胞可定向分化為多種造血以外的組織，特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細(xì)胞，例如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、腱細(xì)胞、肌肉細(xì)胞
2、、神經(jīng)細(xì)胞等。另外間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)體外獲取容易，創(chuàng)傷微小，具有無限增殖和多向分化的潛能，再加上BMSCs具有貼壁生長(zhǎng)的特性，在體外易分離和擴(kuò)增，還易于外源基因的轉(zhuǎn)入和表達(dá)，所以BMSCs受到醫(yī)學(xué)界的青睞，它成為一種理想的細(xì)胞治療工具和基因治療的靶細(xì)胞。開創(chuàng)了再生醫(yī)學(xué)和組織工程的先河。然而間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中的含量很低，需要進(jìn)行體外分離純化和大量增殖。這是目前面臨的主要問題。目的通過觀察不同血清微環(huán)境對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖狀態(tài)的影響得到一種更適合BMSCs體外生長(zhǎng)的環(huán)境，以利于改良骨髓
3、間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，提高體外培養(yǎng)的獲得率，以便于其體外擴(kuò)增和純化，更好的應(yīng)用于臨床治療。方法自6-8W齡SD雄性大鼠股骨、脛骨和腓骨中分離提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)。分別給于以下三種血清微環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)：同種異體血中文摘要清組：分離提取細(xì)胞后原代用含10％大鼠同種異體血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，以后換液傳代時(shí)用含10％胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；胎牛血清組：分離提取細(xì)胞后原代用含10％胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，以后換液傳代時(shí)仍用含10％胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；無血清組：分離提取細(xì)胞后原代用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，以后換液傳代時(shí)用含1
4、0％胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察不同血清微環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同血清微環(huán)境培養(yǎng)條件下的細(xì)胞表面分子CD45和CD90的表達(dá)。應(yīng)用SPSSl7．0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。9士甲；口木大鼠同種異體血清微環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)較小，呈紡錘狀，網(wǎng)狀生長(zhǎng)。10％胎牛血清微環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞呈梭形成纖維樣，集落式生長(zhǎng)。無血清微環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞稀少，只有稍許集落式生長(zhǎng)。生長(zhǎng)曲線中大鼠同種異體血清組倍增速度最快，其次為10％胎牛血清組，而無血清組未見明顯倍增速率。流式細(xì)胞儀檢測(cè)含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下各組第三代細(xì)
5、胞的CD90陽性表達(dá)率均在80％以上，CD45陽性表達(dá)率在2％以下。而在無血清培養(yǎng)條件下CD90陽性表達(dá)率在74．09％，CD45陽性表達(dá)率卻在6．09％。這說明無血清微環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞純度明顯低于含血清微環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞。結(jié)論在含體積分?jǐn)?shù)為10％的大鼠同種異體血清微環(huán)境培養(yǎng)條件下所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一性好，融合度均高于其他組，且細(xì)胞首次傳代的時(shí)間明顯短于其他血清微環(huán)境。且含體積分?jǐn)?shù)為10％的大鼠同種異體血清和10％胎牛血清均適合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)，但在同種異體血清微環(huán)境下細(xì)胞增殖更快，而在無血清培養(yǎng)條件下未見明顯增殖現(xiàn)象。根據(jù)以上結(jié)果表明
6、同種異體血清微環(huán)境下更適于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)和純化，更有利于體外培養(yǎng)方法的改良。關(guān)鍵詞：微環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞同種異體血清大鼠純化UAbstractImprovementofbonemarrowstromalstemcellsinvitroculturemethodMastercandidateYupeiDiaoAssociateprof．MingminDongCollegeofclinicalmedicine，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001，ChinaBonemarrowmesenchym
7、alstemcells(bonemesenchymalstemcells，BMSCs)alsocalledbonemarrowstromalsourceofstemcells，existinbonemalTowhematopoieticstemcellsinadditiontotheoutsideanotherkindhasthemultiplexdifferentiationpotentialofstemcells。Incertaininductionconditions，thiskindofcelldifferentiationcanbe
8、directedforavarietyofhematopoieticoutsideoftheorganization，especiallymesodermandne
