mtor通路參與柯薩奇病毒b3誘導(dǎo)的hela細(xì)胞凋亡機(jī)制研究

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1、萬方數(shù)據(jù)中圖分類號(hào)R725．4．R34博士學(xué)位論文學(xué)校代碼!Q§圣蘭密級(jí)公玨mTOR通路參與柯薩奇病毒B3誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡機(jī)制研究TheresearchaboutmechanismofthemTORsignalingpathwaytakingpartintheCoxsackievirusB3一inducedapoptosisofHeLacells作者姓名：學(xué)科專業(yè)：研究方向：學(xué)院(系、所)：指導(dǎo)教師：李欣臨床醫(yī)學(xué)兒科學(xué)湘雅三醫(yī)院楊作成教授論文答辯日期蘭!竺!：：：答辯委員會(huì)主席中南大學(xué)二0一四年三月萬方數(shù)據(jù)本課題獲得以下

2、基金資助：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30973233)；中南大學(xué)2012年研究生自主創(chuàng)新課題(2012zzts035)；湘雅三醫(yī)院重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)資金(2010，66)IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIlY2688784萬方數(shù)據(jù)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明，所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了論文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中南大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我共同工作的同志對(duì)本研究所作的貢獻(xiàn)均己在論文中

3、作了明確的說明。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。作者簽名：!§蘭日期：生年上月叢日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者和指導(dǎo)教師完全了解中南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定：即學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交學(xué)位論文的復(fù)印件和電子版；本人允許本學(xué)位論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢詫⒈緦W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用復(fù)印、縮印或其它手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密論文待解密后適應(yīng)本聲明。作者簽名：A期：魚壁年三月坐日導(dǎo)師簽名綈易r總文日期：塑年上月蘭IEI萬方數(shù)據(jù)mTOR通路參與柯薩奇

4、病毒B3誘導(dǎo)的HeLa坌m胞凋亡機(jī)制研究摘要目的：分別通過mTOR和P13K抑制劑干預(yù)以及基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立mTOR及相關(guān)通路抑制和其下游分子過表達(dá)后CVB3感染HeLa細(xì)胞模型，觀察CVB3誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)和凋亡情況及CVB3復(fù)制、凋亡相關(guān)分子的變化，以探討P13豳，AWmTOR信號(hào)通路在CVB3感染后導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡中的作用。方法：首先，選用人宮頸癌細(xì)胞株(HeLa)建立經(jīng)典CVB3感染細(xì)胞模型，分別用mTOR抑制劑一雷帕霉素及P13K抑制劑一LY294002對(duì)模型進(jìn)行干預(yù)，采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，半定

5、量PCR，WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞凋亡因子Bim、Bax、Caspase．9、Caspase．3及CVB3表達(dá)變化；其次，通過細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)分別構(gòu)建4EBPl、p70S6K、Aktl和Akt2過表達(dá)HeLa細(xì)胞系，建立CVB3感染細(xì)胞模型，采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Real．timePCR和westemBlot檢測(cè)細(xì)胞凋亡因子Bim、Bax、Caspase．9、Caspase一3及CVB3表達(dá)變化，免疫熒光及細(xì)胞電鏡技術(shù)檢測(cè)病毒復(fù)制情況。最后應(yīng)用SPSSl6．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：(1)雷帕霉素、LY294002均可抑常lJHeLa細(xì)胞活性，并呈濃度依賴效應(yīng)；(2)雷帕霉素、LY294002對(duì)CVB3復(fù)制的作用不同但均可促進(jìn)CVB3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；(3)雷帕霉素和LY294002可阻斷CVB3對(duì)Bim活性的抑制作用，進(jìn)一步促進(jìn)CVB3誘導(dǎo)的Bax活化；(4)雷帕霉素和LY294002促進(jìn)CVB3誘導(dǎo)的Caspase．9活化，同時(shí)促進(jìn)Caspase．3的自我裂解，以啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)；(5)空質(zhì)粒過表達(dá)細(xì)胞株建立后，以正常HeLa細(xì)胞作為對(duì)照組進(jìn)行WesternBloting驗(yàn)證

7、，pcDNA3．1．myc．HisA(．)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組可見myc標(biāo)簽蛋白的表達(dá)；(6)不同基因過表達(dá)細(xì)胞株建立后，提取細(xì)胞總蛋白，以正常HeLa細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)空質(zhì)粒HeLa細(xì)胞為對(duì)照組進(jìn)行WestemBlotinglI萬方數(shù)據(jù)驗(yàn)證，可見質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組分別可見4EBPl、p70S6K、Aktl和轉(zhuǎn)基因A1【t2表達(dá)明顯增高；(7)過表達(dá)4EBP1、p70S6K、Aktl或Akt2可促進(jìn)CVB3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞病變效應(yīng)；(8)過表達(dá)p70S6K、Aktl或Akt2可促進(jìn)CVB3mRNA合成而抑制VPl表達(dá)，過表達(dá)4EBPl貝,1]抑

8、制CVB3mRNA合成而促進(jìn)VPl表達(dá)；(9)CVB3誘導(dǎo)的Bim矛HBax的表達(dá)可被過表達(dá)4EBPl、p70S6K抑制，同時(shí)可被過表達(dá)Akt進(jìn)一步活化；(10)CVB3誘導(dǎo)的Procaspase．9、Caspase．3自我裂解可被過表達(dá)4EBPl、p70S6K激活，同時(shí)被被