去乙酰化組蛋白酶1在馬兜鈴酸腎病發(fā)病機(jī)制中的作用研究

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1、分類號(hào)S825.1學(xué)校代碼10129UDC577學(xué)號(hào)2009301026去乙?；M蛋白酶1在馬兜鈴酸腎病發(fā)病機(jī)制中的作用研究StudiesoftheRoleofHDAC1intheDevelopinginAAN申請(qǐng)人：楊洋學(xué)科門(mén)類：農(nóng)學(xué)學(xué)科專業(yè)：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究方向：獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)指導(dǎo)教師：李培鋒教授論文提交日期：二〇一二年三月摘要馬兜鈴酸腎?。ˋristolochicAcidNephropathy，AAN)指長(zhǎng)期或過(guò)量使用含有馬兜鈴酸（AristolochicAcid，AA）成分的中草藥導(dǎo)致的腎小管間質(zhì)病變。馬兜鈴酸Ⅰ（aristolochcacidⅠ,AAⅠ）是AA中含量最高、毒性最強(qiáng)的

2、成分，可引起上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞壞死或凋亡，觸發(fā)腎間質(zhì)纖維化。在纖維化過(guò)程中，上皮、內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT/EnMT）為肌成纖維細(xì)胞，被認(rèn)為是在腎臟纖維化疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用的重要因素之一。EMT的信號(hào)由各種生長(zhǎng)因子/細(xì)胞因子集調(diào)節(jié)，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforminggrowthfactor-β）被認(rèn)為是EMT產(chǎn)生肌成纖維細(xì)胞最有力的生長(zhǎng)因素之一。通常認(rèn)為與其相關(guān)的受體、Smads蛋白、輔助因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的靶基因共同組成了一個(gè)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路。Smads蛋白有三種亞型：受體激活Smads蛋白（R-Smad）；共同介質(zhì)型Smads蛋白（Co-Sm

3、ad4）；抑制型Smads蛋白（I-Smad6、7）。其中I-Smads在蛋白降解方面以及對(duì)TGF-β信號(hào)的調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。乙?；腟mad7可定向結(jié)合去乙?；M蛋白酶1（histonedeacetylases1,HDAC1）使其去乙?；M(jìn)行泛素化作用促進(jìn)蛋白的降解，當(dāng)HDAC1過(guò)度表達(dá)并被轉(zhuǎn)錄因子募集時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致與其相關(guān)的特定基因被非正常性抑制，從而導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。因此，闡明Smad7的去乙?；饔迷赥GF-β/Smad7信號(hào)通路中對(duì)AAN的調(diào)控，了解分析HDAC1在AAN發(fā)病過(guò)程中的基因和蛋白表達(dá)以及蛋白定位，對(duì)于進(jìn)一步揭示馬兜鈴酸腎病具有重要的意義。為此，本研究復(fù)制了小鼠A

4、AN模型和小鼠原代RTECs細(xì)胞AAN模型，觀察了AAⅠ所致小鼠AAN的病理學(xué)特征，研究了AAⅠ作用下小鼠RTECs腎纖維化中相關(guān)因子及TGF-β1/Smads信號(hào)通路分子相關(guān)基因及蛋白表達(dá)水平變化，分析了引起細(xì)胞纖維化的分子機(jī)制，探討了在AAⅠ作用下小鼠腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)理。其主要研究?jī)?nèi)容如下：AAⅠ對(duì)AAN和TGF-β1/Smads信號(hào)通路中相關(guān)因子的基因和蛋白表達(dá)的影響通過(guò)復(fù)制小鼠馬兜鈴酸腎纖維化（AAN）模型，檢測(cè)腎組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、Smad7和去乙?；鞍酌?（HDAC1）的mRNA和蛋白，分析AAN模型TGF-β1信號(hào)通路中HADC1和Smad7蛋白的分布

5、與表達(dá)變化。免疫組織化學(xué)檢測(cè)CK-18、α-SMA的蛋白表達(dá)，定位HADC1和Smad7蛋白；HE染色觀察腎臟的病理學(xué)變化；RT-PCR檢測(cè)TGF-β1、Smad7和HDAC1的mRNA表達(dá)；ELASA檢測(cè)TGF-β1的蛋白表達(dá)；WesternBlot和免疫共沉淀檢測(cè)HADC1和Smad7蛋白表達(dá)及相互作用。結(jié)果表明，免疫組化結(jié)果顯示染毒組小鼠CK-18表達(dá)陰性，CK-18表達(dá)依次減弱趨勢(shì)；α-SMA表達(dá)陽(yáng)性，并隨給藥劑量逐漸增強(qiáng)。腎臟病理表現(xiàn)為腎小管濁腫、變性和脫落等急性小管間質(zhì)損傷并隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)逐漸加重的趨勢(shì)。AAN模型腎組織中TGF-β1和HDAC1mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性升

6、高，TGF-β1mRNA表達(dá)較對(duì)照組具有顯著性差異（P<0.05），TGF-β1蛋白從28d開(kāi)始顯著升高，且與對(duì)照組比較差異極顯著（P<0.01）；Smad7mRNA和蛋白表達(dá)均呈下降趨勢(shì)，且自35d開(kāi)始較對(duì)照組有顯著性的下降（P<0.05）；HDAC1mRNA和蛋白表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，28d開(kāi)始AAN組中HDAC1mRNA水平極顯著高于對(duì)照組（P<0.01）；HDAC1蛋白免疫組化染色強(qiáng)度呈上調(diào)趨勢(shì)，且HDAC1陽(yáng)性著色主要分布于上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核；免疫共沉淀試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在AAN中HDAC1與Smad7形成蛋白復(fù)合物。結(jié)論為成功復(fù)制了小鼠AAN模型，證實(shí)AAⅠ對(duì)小鼠腎臟具有

7、明顯的損害作用，表現(xiàn)為早期腎間質(zhì)纖維化，證實(shí)了腎小管上皮細(xì)胞是AAⅠ作用的主要靶細(xì)胞。AAⅠ對(duì)AAN的發(fā)展具有時(shí)間和劑量依賴型作用，TGF-β1/Smad7信號(hào)參與了AAⅠ誘導(dǎo)的EMT，Smad7是AAⅠ作用的靶點(diǎn)之一。HDACl蛋白高表達(dá)并與Smad7蛋白形成蛋白復(fù)合物，參與了TGF-β/Smad信號(hào)通路介導(dǎo)的AAN形成過(guò)程。AAⅠ對(duì)小鼠原代RTECs中TGF-β1/Smads信號(hào)通路中相關(guān)因子