廣州管圓線蟲不同發(fā)育時期差異蛋白表達的研究

《廣州管圓線蟲不同發(fā)育時期差異蛋白表達的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文廣州管圓線蟲不同發(fā)育時期差異蛋白表達的研究姓名：宋增梅申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：臨床檢驗診斷學(xué)指導(dǎo)教師：潘長旺；黃慧聰2012-05-22溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文廣州管圓線蟲不同發(fā)育時期蛋白差異表達的研究中文摘要廣州管圓線蟲病(angiostrongyliasiscantonensis)，是由廣州管圓線蟲(Angiostrongyluscantonensis)幼蟲侵害人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的，是一種人獸共患寄生蟲病。寄生蟲需要通過改變宿主來完成其生活史，因此，他們有根據(jù)宿主環(huán)境來調(diào)節(jié)基因的差異表達的能力。廣州管圓線蟲生活史的完成需要幾個不同的宿主。成蟲寄生在正常

2、宿主大鼠體內(nèi)，大鼠可排出I期幼蟲，I期幼蟲經(jīng)水進入中間宿主如福壽螺等軟體動物體內(nèi)，并發(fā)育成為Ⅲ期幼蟲；Ill期幼蟲感染大鼠后，穿過血腦屏障發(fā)展成Ⅳ、V期幼蟲，再移行至心、肺部血管內(nèi)發(fā)育成成蟲。蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和相互作用以及基礎(chǔ)生物學(xué)的典范，可以從整體層次上，更精確、貼切地反映蛋白質(zhì)的表達情況。而線蟲是最好的研究模式生物之一。差異蛋白質(zhì)組學(xué)主要用于篩選和鑒定不同種類和狀態(tài)下各樣本蛋白質(zhì)組之間的區(qū)別和變化，尋找任何能引起樣本間差異蛋白質(zhì)譜的有意義的因素，從而能進一步認識個體生理的發(fā)展與變化。雙向熒光差異凝膠電泳相對于傳統(tǒng)的雙向電泳能夠避免膠與膠之間的變異并提高

3、敏感性，在發(fā)育生物學(xué)和組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究中更顯其優(yōu)勢。本研究運用雙向熒光差異凝膠電泳和質(zhì)譜相結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析鑒定廣州管圓線蟲不同發(fā)育時期的差異表達蛋白質(zhì)。目的1．應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向熒光差異凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定廣州管圓線蟲ⅡI期幼蟲、V期雌雄蟲和雌雄成蟲的差異表達蛋白質(zhì)。2．建立一個穩(wěn)定的廣州管圓線蟲不同發(fā)育時期蛋白質(zhì)組的雙向熒光差異凝膠電泳圖譜，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對廣州管圓線蟲不同發(fā)育時期的差異表達蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜分析和鑒定，建立一個可靠的蛋白質(zhì)組學(xué)生物技術(shù)。3．探討可能與廣州管圓線蟲不同發(fā)育時期的生長發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)，可以為宿主環(huán)境在寄生蟲發(fā)

4、育過程中的調(diào)控或宿主一寄生蟲相互作用中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)提供依據(jù)。方法1．廣州管圓線蟲蟲體的收集：實驗室條件下建立廣州管圓線蟲生活史，分別于感染的不同時期收集廣州管圓線蟲ⅡI期幼蟲、V期雌蟲、V期雄蟲、雌成蟲溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文和雄成蟲，蟲體用0．01mol／LPBS緩沖液洗滌3次后，-80。C凍存。2．蛋白樣品的制備：將收集的蟲體分別使用裂解液裂解、超聲裂解、離心，獲得的上清，使用Bio．Radproteinassayreagent測定蛋白質(zhì)濃度。分裝后-80。C低溫保存。3．CyDye染料標記蛋白質(zhì)：分別用Cy3或Cy5標記樣品，Cy2標記內(nèi)標。4．雙向熒光差異凝膠電泳(2D．

5、DIGE)4．1第一向等電聚焦(IEF)4．2膠條的平衡4．3第二向SDS．PAGE電泳：12．5％的SDS．PAGE凝膠5．雙向熒光凝膠電泳的圖像掃描：利用U]VIaxPowerlook2110XL和TyphoonFLA9000對電泳后的膠板圖像掃描，得到不同顏色的掃描圖。6．DeCyder7．0圖像分析7．質(zhì)譜鑒定：膠內(nèi)酶解，抽提酶解肽段，ZipTip脫鹽，MALDI．TOF．MS鑒定、數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果1．對廣州管圓線蟲5個樣品及內(nèi)標進行雙向熒光差異凝膠電泳后，得到了清晰的蛋白質(zhì)表達譜。用UMaxPowerlook2110XL和TyphoonFLA9000激光掃描儀于熒光模式

6、下進行Cy2、Cy3、Cy5激光掃描，8塊張膠共得到24張熒光掃描圖譜。2．經(jīng)過DeCyder7．0軟件分析，校準后，蛋白表達差異值經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析(f檢驗)，篩選出在24張圖譜中均出現(xiàn)的點共183個蛋白點。與成蟲相比，314、537、698、925和980這5個蛋白點在V期幼蟲中表達上調(diào)，但沒有表現(xiàn)出顯著的性別差異；與IⅡ期幼蟲相比，點469、488、609、855、859、885、1253、1520和1416等89個蛋白點在成蟲和V期幼蟲中上調(diào)，相反的，點623、730、1053、1161和1060等13個蛋白點在IⅡ期幼蟲中出現(xiàn)明顯上調(diào)；雌雄蟲及V期幼蟲雌雄比較中，點1496

7、在雄蟲和V期幼蟲雄蟲中均表達上調(diào)。3．質(zhì)譜分析差異蛋白點，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定了其中37個蛋白質(zhì)。10．81％是細胞骨架相關(guān)蛋白，如肌動蛋白和副肌球蛋白；64．86％功能蛋白與代謝過程、免疫反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)，如熱休克蛋白和變換域相關(guān)蛋白；24．32％是未知的蛋白質(zhì)。這些差異表達蛋白在細胞黏附、細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、蛋白質(zhì)水解、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等許多生理和病理過程。4．與V期雌蟲相比，過氧化物氧還蛋白(1253)、吲哚胺2，3雙加氧酶(1520)和TRRAP．1ik