球孢白僵菌的退化與dna甲基化關(guān)系的初步研究

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1、分類號：Q939.9單位代碼：10364密級：學(xué)號：11720416安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文球孢白僵菌的退化與DNA甲基化關(guān)系的初步研究PreliminarystudyontherelationshipbetweendegradationofBeauveriabassianaandDNAmethylation研究生：汪超指導(dǎo)教師：黃勃教授合作指導(dǎo)教師：申請學(xué)位門類級別：理學(xué)碩士專業(yè)名稱：微生物學(xué)研究方向：分子生物學(xué)所在學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院答辯委員會主席：二零一四年六月萬方數(shù)據(jù)獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及

2、取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：簽字日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子文件，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，收錄到《中國

3、學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文，向社會公眾提供信息服務(wù)。（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書）。學(xué)位論文作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：簽字日期：年月日簽字日期：年月日學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位：電話：通信地址：郵編：萬方數(shù)據(jù)球孢白僵菌的退化與DNA甲基化關(guān)系的初步研究摘要球孢白僵菌Beauveriabassiana（以下簡稱白僵菌）具有侵染力強、分布廣以及流行快的特點；同時也具有易于培養(yǎng)，不污染環(huán)境等優(yōu)勢。因此，作為重要的昆蟲病原真菌，白僵菌目前已廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)害蟲生物防治。然而，在實驗室

4、培養(yǎng)和工業(yè)生產(chǎn)過程中，白僵菌也普遍存在著菌體退化問題。白僵菌菌體退化對于其發(fā)酵生產(chǎn)及殺蟲效果有著直接的負(fù)面影響。研究表明，DNA甲基化修飾普遍存在于生物生命過程中。它通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)使生物體在生長發(fā)育過程中產(chǎn)生出不同的性狀。因此，揭示球孢白僵菌在培養(yǎng)過程中菌體退化與其DNA甲基化的關(guān)系，可以為今后進一步研究白僵菌表觀遺傳學(xué)以及DNA甲基化在菌體生長發(fā)育機制中的具體功能提供基礎(chǔ)材料和科學(xué)依據(jù)，同時也將為白僵菌的規(guī)?；l(fā)酵與產(chǎn)業(yè)化奠定更加堅實的理論基礎(chǔ)。本研究采用RACE技術(shù)克隆出球孢白僵菌DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因Dim-2全序列，并通過

5、生物信息學(xué)方法，對該蛋白進行了同源序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹分析。同時，本研究還利用Realtime-PCR技術(shù)和HPLC技術(shù)對球孢白僵菌在生長發(fā)育過程中Dim-2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)以及基因組DNA中5-甲基胞嘧啶的含量進行了檢測，分析了球孢白僵菌生長發(fā)育過程中DNA甲基化的變化情況。序列分析表明，球孢白僵菌Dim-2基因cDNA序列全長為4021bp，編碼了1142個氨基酸。其5’非翻譯區(qū)（5’-UTR）與3’非翻譯區(qū)（3’-UTR）分別為283個核苷酸和303個核苷酸。預(yù)測的白僵菌DIM-2編碼蛋白分子量為128kD，理論等電點6.13。利

6、用NCBI提供的蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫（CDD）平臺對球孢白僵菌Dim-2基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測。結(jié)果顯示，該蛋白含有能催化合成5-甲基胞嘧啶的活性區(qū)域以及一個BAH結(jié)構(gòu)域。蛋白多序列比對與進化樹分析顯示，球孢白僵菌Dim-2基因編碼蛋白與GenBank中已登錄注釋的蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)、輪枝菌（Verticilliumalboatrum）、粗糙脈孢霉（Neurosporacrassa）、巴西芽生菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)等11種真菌的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有高度同源性。包括

7、白僵菌DIM-2編碼蛋白在內(nèi)的12種真菌DNA甲基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列共聚成兩個群。其中與球孢白僵菌Dim-2基因編碼蛋白關(guān)系最近的蛹蟲草DIM-2蛋白，二者一致性達(dá)到了63%。將本實驗室保存的球孢白僵菌Bb2005單孢株點接于SDAY培養(yǎng)基中，25℃下每十天傳代培養(yǎng)一次，并觀察菌體生長與產(chǎn)孢情況。菌落形態(tài)學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，在1~3代時，白僵菌Bb2005菌落呈規(guī)則的圓形，5天后開始產(chǎn)孢，第7天形成大量孢子；而第4代培養(yǎng)時，菌體開始出現(xiàn)不規(guī)則的扇形角變區(qū)域，且產(chǎn)孢變少；培養(yǎng)至第10代時出現(xiàn)菌絲生長旺盛，產(chǎn)孢明顯減少的狀態(tài)；而培養(yǎng)至第25代時白僵

8、菌Bb2005已完全I萬方數(shù)據(jù)退化，菌絲瘋長且很少產(chǎn)孢。利用Realtime-PCR與HPLC技術(shù)分別對第1代、第25代和復(fù)壯后的球孢白僵菌Bb2005菌株在第3、5、7、10、15天培養(yǎng)時的Dim-2基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量和基