豬偽狂犬病毒ge抗體檢測紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)方法和金標(biāo)免疫層析法的建立與應(yīng)用

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1、immunochromatographicstripissimpleandtheresultc鋤bejudgedwitIlnakedeyesin15minutes；storageofthestripsatroomtemperatureforsixmonthshasnotchangedtheirsensitivityandspecificity．ComparedwiththeresultsfromtheAmericanIDEXXandtheFrenchLSIgE-ELISAantibodydetectioncases，theto

2、talcoincidencerateofthenegativeandpositivereactionreached90．60％．The—seresultssuggestthattheestablishedColloidalGoldImmunochromatographyAssayCanbeusedtodetecttheporcineserumantibodiestogEproteinofPRVwiththeadvantagesofsimpleoperation，hi曲sensibilityandstrongspecificit

3、y．KEYWORDS：PseudorabiesVirus；Anti—HumanRedBloodCellScFv；Er—ythrocyteAgglutinationAssay；ColloidalGoldImmunochromatographicAssay；V常用縮寫詞VⅡ—1厶—jL．刖『舌偽狂犬病是由偽狂犬病毒引起的一種急性傳染病，在自然條件下可感染豬、野豬、犬、貓、兔、鼠、貂等多種家畜和野生動物【11。以發(fā)熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為特征的一種高度急性、接觸性傳染病[21。國際獸疫局(ore)將偽狂犬病列為法定報(bào)告的B類多

4、種動物共患傳染病，我國也將其列為二類傳染病。偽狂犬病屬于自然疫源性疫病，豬是該病的傳播者和天然宿主，其主要臨床癥狀是引起懷孕母豬繁殖障礙：流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎；新生仔豬體溫升高、呼吸困難[31。任何年齡豬耐過PRV急性感染后，均引起潛伏感染，且終生帶毒，在一定條件下向J,I-掃IE毒，成為傳染源，對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失，是各個(gè)豬場首要凈化的疫病之一。目前，針對國內(nèi)廣泛使用PRVgE基因缺失苗進(jìn)行預(yù)防免疫的現(xiàn)狀，通過檢測gE抗體即可區(qū)分出是疫苗免疫抗體還是野毒感染產(chǎn)生抗體M】，從而篩查野毒感染豬。偽狂犬病毒病原學(xué)檢測方法主要有

5、病毒分離和PCR法，這兩種方法需要的實(shí)驗(yàn)條件高，只適合實(shí)驗(yàn)室的檢測；偽狂犬病血清學(xué)檢測方法主要有微量血清中和試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、血凝試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)【8】等，前面五種都無法區(qū)分疫苗免疫和野毒感染，ELISA方法雖可區(qū)分，但是試劑盒價(jià)格昂貴，且需要專門的操作人員和儀器，難以在基層生產(chǎn)單位推廣。因此，建立簡便、快速、特異、敏感且適合基層單位使用的檢測方法對開展偽狂犬病凈化意義重大。1988年，Kemp【9】等首先報(bào)道了建立檢測HIV抗體的自體紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)快速檢測方法。只需采待檢人一滴血，5m

6、in內(nèi)即可觀察結(jié)果，操作程序簡單，結(jié)果可以目測，不需要特殊昂貴的儀器和專門的技術(shù)人員。其基本原理是：以紅細(xì)胞作為指示劑【lo】，利用重組雙功能融合蛋白既能與紅細(xì)胞結(jié)合又能與被檢抗體／抗原結(jié)合，通過被檢樣品中抗體／抗原的橋聯(lián)作用，使紅細(xì)胞發(fā)生肉眼可見的凝集，根據(jù)紅細(xì)胞的凝集情況可快速進(jìn)行結(jié)果判定。免疫膠體金技術(shù)(ImmuneColloidalgoldtechnique，ict])是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種新型固相載體標(biāo)記免疫檢測技術(shù)。它以膠體金作為標(biāo)記物，利用特異性抗原抗體的反應(yīng)，通過膠體金顆粒的顏色來放大免疫反應(yīng)系統(tǒng)，使

7、反應(yīng)結(jié)果直接在固相載體上顯示出來，用于檢測待測樣品中的抗原或抗體【l¨。其基本原理是：將膠體金標(biāo)記到特異的抗原或抗體并吸附于玻璃纖維膜上，然后固定于硝酸纖維素膜的某一特定位置(一般為頂端)作為膠體金結(jié)合墊，將另一特異的抗原或抗體以條帶狀固定于硝酸纖維素膜上的某特定區(qū)域(檢測帶)，在硝酸纖維素膜上的另一端固定吸水墊；當(dāng)干燥的硝酸纖維素膜一端浸到樣品后，由于毛細(xì)作用，樣品沿著膜向吸水墊端移動，當(dāng)移動至膠體金結(jié)合墊(金標(biāo)墊)時(shí)，如樣品中含有待檢物，則發(fā)生特異性免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，繼續(xù)前移至檢測帶時(shí)，待測物和免疫復(fù)合物與之發(fā)生特異

8、性結(jié)合而被截留在條帶區(qū)域上，通過膠體金標(biāo)記物的富集而得到直觀的顯色結(jié)果[121o根據(jù)紅細(xì)胞凝集的原理，本實(shí)驗(yàn)開展了用于快速檢測豬偽狂犬病抗體雙功能試劑相關(guān)研究工作，利用SOEPCR方法成功構(gòu)建了用于快速檢測豬偽狂犬病gE抗體的雙功能融合基因并在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)，通過對