豬偽狂犬病毒抗體熒光免疫層析檢測(cè)法.pdf

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1、ICS11.220B41團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CVMAX20—2019豬偽狂犬病毒抗體熒光免疫層析檢測(cè)法TheDetectionofPRVAntibodybyHypersensitiveFluorescenceImmunoassay（征求意見(jiàn)稿）CVMA中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)2019—XX—XX發(fā)布2019—XX—XX實(shí)施中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布T/CVMAX20—2019前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省獸醫(yī)協(xié)會(huì)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，成都微瑞生物科

2、技有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳斌、陳弟詩(shī)、周明忠、張毅、陽(yáng)愛(ài)國(guó)、王澤洲、章建、鄧飛、賀冬梅、丁夢(mèng)蝶、裴超信、吳冠英、邱明雙、張永寧、吳宣。CVMA中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)T/CVMAX20—2019豬偽狂犬病毒抗體熒光免疫層析檢測(cè)法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬偽狂犬病毒抗體(gB和gE)熒光免疫層析檢測(cè)法的原理、儀器設(shè)備、操作步驟、結(jié)果分析。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬血清中豬偽狂犬病病毒gB和gE特異性抗體的快速檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全

3、通用要求GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T18088出入境動(dòng)物檢疫采樣NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸及規(guī)范3縮略語(yǔ)HFIA高敏熒光免疫分析方法（TheHypersensitiveFluorescenceImmunoassayHFIA)4原理采用免疫夾心法和高敏熒光免疫分析法相結(jié)合技術(shù)，檢測(cè)動(dòng)物血清樣本中的豬偽狂犬病CVMA抗體(gB中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)和gE)。當(dāng)血清樣本中抗體與高敏熒光納米微球標(biāo)記的偽狂犬重組抗原接觸反應(yīng)后形成復(fù)合物，繼續(xù)與硝酸纖維素膜上檢測(cè)線包被的偽狂犬重組抗原形成夾心復(fù)合物反應(yīng)，其余物質(zhì)繼續(xù)向前層析在C線捕獲住“熒光標(biāo)記雞IgY+山羊抗雞Ig

4、Y”免疫結(jié)合物，最后用高敏熒光分析儀讀取檢測(cè)卡上的熒光信號(hào)。5儀器、材料與試劑5.1儀器5.1.1高敏熒光分析儀：能在激發(fā)波長(zhǎng)為(400±20)nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為(615±10)nm條件下檢測(cè)。5.1.2單道可調(diào)移液器（20～200μL）和（0.5～10μL）。5.1.3分析天平：0.0001g。T/CVMAX20—20195.1.4離心機(jī)。5.1.5冰箱。5.2材料5.2.1豬偽狂犬病毒抗體(gB和gE)陽(yáng)性血清。5.2.2豬偽狂犬病毒抗體(gB和gE)高敏熒光免疫分析法檢測(cè)試劑卡（圖1）：硝酸纖維膜上包被有豬偽狂犬病毒重組抗原，用于樣品中豬偽狂犬病毒抗體與高敏熒光納米微球標(biāo)記偽狂犬重

5、組抗原反應(yīng)后，再與硝酸纖維素膜上包被的偽狂犬重組抗原反應(yīng)。圖1豬偽狂犬病毒抗體熒光免疫層析檢測(cè)法試劑卡示意圖5.3試劑5.3.1水：按照GB/T6682中的要求，二級(jí)。5.3.2樣品稀釋液（見(jiàn)附錄A）。5.3.3鑭系熒光納米微球：熒光壽命≥400μsCVMA6樣品采集與處理中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)6.1樣品的采集應(yīng)按照NY/T541-2002《動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)采樣方法》中的規(guī)定進(jìn)行，并做好安全防護(hù)。按常規(guī)方法用干燥、潔凈的離心管或適當(dāng)容器采集3～5mL血液。6.2樣品的處理血液樣本用離心機(jī)3000r/m離心3min，血清量不少于500μL。6.3樣品的貯存T/CVMAX20—2019血清樣本在2

6、-8℃冷藏可保存24小時(shí)，如需長(zhǎng)期保存應(yīng)置-20℃或-80℃。7檢測(cè)方法7.1樣品稀釋待檢血清樣本和豬偽狂犬病毒抗體熒光免疫層析檢測(cè)法試劑卡從2-8℃取出，平衡到室溫(25℃左右）。用樣品稀釋液將待測(cè)血清樣本按1:20稀釋。7.2加樣從原包裝鋁箔袋中取出豬偽狂犬病毒抗體熒光免疫層析檢測(cè)法試劑卡，置于平凈平坦的臺(tái)面上，用移液器吸取離心管中事先準(zhǔn)備好的已稀釋好的檢測(cè)樣本垂直滴加80μL于加樣孔內(nèi)。7.3檢測(cè)避光層析15min后用高敏熒光分析儀檢測(cè)。8結(jié)果計(jì)算B—高敏熒光分析儀讀取標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的檢測(cè)卡上的熒光信號(hào)T/C值BO—高敏熒光分析儀讀取稀釋液檢測(cè)卡上的熒光信號(hào)的T/C值以標(biāo)準(zhǔn)品

7、B-BO值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以豬偽狂犬病毒抗體陽(yáng)性血清效價(jià)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，CVMA繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的熒光信號(hào)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的樣中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)本中豬偽狂犬抗體效價(jià)。注：軟件自帶計(jì)算功能，能準(zhǔn)確算出當(dāng)前樣本T/C值所對(duì)應(yīng)的豬偽狂犬病毒抗體效價(jià)。9檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)豬偽狂犬gB抗體效價(jià)檢測(cè)：檢測(cè)結(jié)果大于32時(shí)抗體水平為陽(yáng)性，小于16時(shí)抗體水平為陰性，16～32之間為可疑區(qū)。豬偽狂犬gE抗體效價(jià)檢測(cè)：檢測(cè)結(jié)果大于32時(shí)抗體水