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1、飼料中植酸酶活性測定方法探討摘要:參照國標(biāo)測定植酸酶活性的方法,研究了鉬黃法和鉬藍(lán)法的穩(wěn)定性及植酸酶活性測定時反應(yīng)體系中緩沖液、pH值以及Cu、Zn、Mn金屬離子對酶活性的影響。結(jié)果表明:鉬黃法與改進(jìn)后的鉬藍(lán)法穩(wěn)定性沒有明顯差異,但鉬藍(lán)法更適合微量磷的測定;檸檬酸鹽緩沖液作為植酸酶酶解反應(yīng)的緩沖體系時顯色的穩(wěn)定性較差;反應(yīng)溫度、pH及Cu、Zn金屬離子對酶活性影響較大,測定植酸酶活性時需要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件,屏蔽金屬離子的干擾。關(guān)鍵詞:飼料;植酸酶;活性;測定目前,植酸酶制劑在畜禽飼料生產(chǎn)中已得到廣泛應(yīng)用,但飼料中植酸酶活性的測定方法還存在一些爭
2、議。2002年,國家頒布了飼用植酸酶活性的測定方法標(biāo)準(zhǔn)(GB/T18634)2002),該標(biāo)準(zhǔn)注明其適用于飼料添加劑用的植酸酶產(chǎn)品,也適用于添加有植酸酶的配合飼料、濃縮飼料和添加劑預(yù)混合飼料,但配合飼料、濃縮飼料和添加劑預(yù)混合飼料成分顯然更為復(fù)雜,其適用性受到質(zhì)疑[1]。因此,關(guān)于飼料中植酸酶活性測定方法問題有待進(jìn)一步研究。1試驗(yàn)材料與方法1.1主要儀器與設(shè)備電熱恒溫水浴鍋(室溫-100e,控溫精度?1e)、離心機(jī)(最高轉(zhuǎn)速6000r/min)、721型分光光度計(jì)、分析天平、pH計(jì)、磁力攪拌器、0.22Lm微孔濾膜。1.2試劑1.2.1偏釩酸銨
3、-鉬酸銨-硝酸顯色液方法見GB/T18634)2002。1.2.2鹽酸-乙酸鈉緩沖液方法見GB/T18634)2002乙酸緩沖液(I)的配制。1.2.3磷標(biāo)準(zhǔn)溶液將磷酸二氫鉀于105e恒溫箱中干燥2h,在干燥器中保存;稱取磷酸二氫鉀0.0203g,溶解于蒸餾水中定容至100ml。1.2.4植酸酶溶液方法見GB/T18634)2002。1.2.5植酸鈉溶液方法見GB/T18634)2002。1.2.6硫酸-鉬酸銨溶液量取20ml濃硫酸(98%)于100ml蒸餾水中,稱取1.500g鉬酸銨微熱溶解于50ml蒸餾水中,按比例混合待用。1.2.7抗壞血
4、酸溶液稱取5.400g抗壞血酸用蒸餾水溶解,定容至100m,l于4e冰箱保存待用。1.2.8檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液按一定體積比混合0.1mol/L檸檬酸溶液和0.1mol/L檸檬酸鈉溶液,用pH計(jì)調(diào)節(jié),使其pH值分別至2.50、3.50、4.50、5.50、6.50、7.50。1.2.9SnCl2-甘油溶液稱取2.501gSnCl2溶解于100ml甘油中,避光保存,溶液可穩(wěn)定數(shù)周。1.2.10鉬酸銨-硫酸-酒石酸氧銻鉀顯色液量取硫酸-鉬酸銨溶液150m,l稱取0.070g酒石酸氧銻鉀溶于20ml蒸餾水,將以上溶液混合待用。1.2.11三氯乙酸溶
5、液量取三氯乙酸15ml用蒸餾水定容至100ml。1.2.12硫酸鋅溶液稱取0.0885gZnSO4#7H2O于100ml容量瓶中,用pH5.50鹽酸-乙酸鈉緩沖液溶解并定容至刻度,搖勻。1.2.13硫酸銅溶液稱取0.0782gCuSO4#5H2O于100ml容量瓶中,用pH5.50鹽酸-乙酸鈉緩沖液溶解并定容至刻度,搖勻。1.2.14硫酸錳溶液稱取0.0615gMnSO4#H2O于100ml容量瓶中,用pH5.50鹽酸-乙酸鈉緩沖液溶解并定容至刻度,搖勻。1.3試驗(yàn)方法1.3.1植酸酶活性單位的定義國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18634)2002定義:植酸
6、酶樣品在植酸鈉濃度為5.0mmol/L、溫度37e、pH值5.50的條件下,每1min從植酸鈉中釋放1Lmol無機(jī)磷,即為一個植酸酶活性單位,以/U0表示。1.3.2測定原理鉬黃法(偏釩酸銨法)原理:植酸酶在一定溫度和pH值條件下,水解底物植酸鈉,生成正磷酸和肌醇衍生物,在酸性環(huán)境中,用釩鉬酸銨處理生成黃色復(fù)合物,在415nm波長下進(jìn)行比色分析。鉬藍(lán)法原理:植酸酶在一定溫度和pH值條件下,水解底物植酸鈉,生成正磷酸和肌醇衍生物,在酸性環(huán)境中,用鉬酸42萬丹等:飼料中植酸酶活性測定方法探討/2007年第11期銨處理生成藍(lán)色復(fù)合物,在810nm波長
7、下進(jìn)行比色分析。1.3.3鉬藍(lán)法反應(yīng)條件的探討1.3.3.1SnCl2-甘油溶液和抗壞血酸-酒石酸氧銻鉀作反應(yīng)體系還原劑的比較分別取磷標(biāo)準(zhǔn)溶液2ml放至4個50ml容量瓶中,分A、B組,每組2個平行樣。A組分別加入4ml鉬酸銨-硫酸-酒石酸氧銻鉀顯色液,1ml抗壞血酸溶液,定容至50m;lB組分別加入4滴SnCl2-甘油溶液,2ml硫酸-鉬酸銨溶液,定容至50ml。均在室溫下靜置20min,于810nm波長下測定其吸光值。1.3.3.2反應(yīng)體系的溫度及加熱時間的探討以酒石酸氧銻鉀-抗壞血酸作還原劑,試劑的添加量同3.1.3.1中A組,定容搖勻后
8、分別在40、50、60、70和100e下加熱5、10和15min,立即冷卻至室溫,測定吸光值。1.3.3.3鉬黃法與鉬藍(lán)法比較參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18
