植酸酶活性的測定--鉬藍法

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1、植酸酶活性的測定——鉬藍法1原理針對預混料復雜的物料體系，用不同的緩沖液對其進行抽提，最大限度的減少飼料中無機磷，微量元素，多維及其他成分對植酸酶測定的影響，用鉬藍法對抽提液中植酸酶活性進行定量。植酸酶在一定溫度和pH條件下，水解底物植酸鈉生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性環(huán)境中與鉬酸銨顯色劑反應生成藍色的（Mo2O3?MoO3）復合物，在波長700nm下比色測定。酶活力單位定義：在37℃、pH5.0條件下，每分鐘從5.0mM植酸鈉溶液中釋放出1微摩爾的無機磷定義為1個酶活力單位（U）2試劑本規(guī)定中所用試劑，在沒有注明其它要求時，均指分析純試劑；所用溶

2、劑和水無注明時，均指蒸餾水。清洗實驗用容器不要用含磷清洗劑。2.1乙酸緩沖液A（0.25mol/L）：稱取14.355g無水乙酸鈉，加入0.5gTritonX-100和0.5g牛血清白蛋白，900ml水溶解，冰乙酸調(diào)pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。2.2乙酸緩沖液B（0.25mol/L）：稱取14.355g無水乙酸鈉，加入1.0g吐溫-20和30gEDTA，900ml水溶解，冰乙酸調(diào)pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。2.3植酸鈉溶液（6.25mmol/L）：稱取577.4mg肌醇六磷酸鈉，加入574.2mg無水乙酸

3、鈉，90ml水溶解，冰乙酸調(diào)pH值至5.00±0.01，水定容至100ml，現(xiàn)用現(xiàn)配（實際反應液中的最終濃度為5.0mmol/L）。2.4終止液：5%三氯乙酸（5%TCA）。2.51.5％鉬酸銨（試劑A）：7.5g鉬酸銨溶于400ml水中，慢慢加入22ml濃硫酸，水定容到500ml，冰箱儲存，有效期1個月。2.62.7％硫酸亞鐵（試劑B）：冰箱儲存，有效期1個月。2.7顯色劑：移取4份試劑A（2.5），1份試劑B（2.6）混合后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。2.8磷酸二氫鉀：稱量前于烘箱中烘至恒重，用乙酸緩沖液（2.2）配制50mmol/L標準液，再用50mmo

4、l/L配制成4.0mmol/L磷酸二氫鉀，溶劑為乙酸緩沖液（2.2），冰箱儲存。3儀器設備恒溫水浴鍋，分光光度計（有10mm比色皿），磁力攪拌器，渦流式混合器，酸度計（精確至小數(shù)點后兩位），離心機（最高轉(zhuǎn)速4,000rpm以上），其它實驗室常用設備。4標準曲線繪制將4.0mmol/L磷酸二氫鉀標準溶液用乙酸緩沖液（2.2）稀釋成0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mmol/L的溶液，按表1的操作步驟一起反應。以無機磷含量為縱坐標（0.2ml以上稀釋液無機磷含量分別為：0.00、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80μmol），以

5、吸光值為橫坐標，繪制標準曲線，列出直線回歸方程（Y=KX+B）。5樣品測定5.1試樣溶液的制備建議稱取5-10g含酶飼料，精確至0.01g，置于100mL容量瓶中，加入乙酸緩沖液（2.1）定容（之前需充分攪拌20min），取其中2-10ml置于另一100ml容量瓶中用乙酸緩沖液（2.2）定容。稀釋的最終結(jié)果應使樣液濃度保持在0.02-0.06U/mL.左右，待反應。55.2反應按下面的反應順序進行操作，在反應過程中，從加入底物（2.3）開始，向每支管中加入試劑的時間間隔要絕對一致，37℃保溫30min。反應步驟及試劑、溶液用量見表A1。表1反應順序

6、樣品，標準樣品空白標準空白樣品稀釋液（ml）0.20.2—乙酸緩沖液(2.2)（ml）——0.237℃預熱5min√√√依次加入底物（2.3）（ml）0.80.8（第二步）0.8（第二步）混合√√√37℃保溫30min√――依次加入終止液（2.4）（ml）1.01.0（第一步）1.0（第一步）依次加入顯色劑（2.7）（ml）1.01.01.0混合√√√總體積（ml）3.03.03.0A5.3樣品測定反應后的試樣在室溫下靜置10min，如出現(xiàn)混濁需在離心機上以4,000rpm離心10min，上清液以標準空白調(diào)零，在分光光度計700nm波長處測定樣品

7、空白（A0）和樣品溶液（A）的吸光值，A－A0為實測吸光值。用直線回歸方程計算樣品植酸酶的活性。A6結(jié)果計算和表示植酸酶活性U按下式計算：K×（A－A0）×VS×m×30U=×F其中：U——樣品植酸酶活性，U/g；K——標準曲線斜率；F——樣品溶液反應前的總稀釋倍數(shù)；S——樣品測試量，表1中S＝0.2ml；V——反應總體積，表1中V=1ml；m——試樣質(zhì)量，g；A0——測定樣品空白吸光值；A——樣品溶液吸光值；30——反應時間，min。兩個平行樣品的測定結(jié)果用算術平均值表示，保留整數(shù)。A7允許差同一樣品兩個平行測定值的相對偏差不大于8％。5Dete

8、rminationofPhytaseActivity——Molybdate-BlueMethodA1.PRINCIPLED