植酸酶活性測定應(yīng)注意的幾個(gè)問題

《植酸酶活性測定應(yīng)注意的幾個(gè)問題》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。

1、劉小春1溫度植酸酶作為一種酶制劑，對溫度非常敏感，溫度低會(huì)降低它的生物活性；溫度高也會(huì)降低其生物活性，甚至完全失活。因此，在檢測過程中對溫度的控制則顯得非常重要，國標(biāo)要求植酸酶活性測定時(shí)的溫度為（37±0?1）°C。在33°C吋植酸酶不能很好地發(fā)揮其活性，酶活與其真實(shí)值相比約低10%；在40°C時(shí)，部分植酸酶會(huì)失活，酶活與其真實(shí)值相比約低8%。另外，水浴加熱時(shí)，水浴液面要超過試管內(nèi)反應(yīng)液液面，使其在規(guī)定時(shí)間內(nèi)充分反應(yīng)。2pH值pH值在酶活測定吋影響很大，國標(biāo)要求pH值為5.5。當(dāng)pH值為3.0時(shí)，植酸酶活力基本消失。盡量不耍用酸度計(jì)來調(diào)節(jié)緩沖液的pH值，因

2、為酸度計(jì)存在一定的誤差，使用時(shí)間長了會(huì)發(fā)生鈍化，使測定的pH值不準(zhǔn)。可以通過計(jì)算緩沖溶液屮H+濃度的方法來配制一定pH值的溶液。如①配制0.25mol/l乙酸緩沖液，加入34.02g三水乙酸鈉、2.78ml濃鹽酸，完全溶解后定容至1000ml,用精密pH試紙測定溶液pH值為5.0。筆者曾用酸度計(jì)對照，配制上述pH值溶液需加入濃鹽酸6ml,1：3鹽酸約20ml,此溶液pH值實(shí)際上已經(jīng)低于5.0,由此說明此酸度計(jì)已經(jīng)反應(yīng)遲鈍。②配制0.25mol/kpH值5.50的乙酸緩沖液，需加入34.02g三水乙酸鈉、劉小春1溫度植酸酶作為一種酶制劑，對溫度非常敏感，溫度

3、低會(huì)降低它的生物活性；溫度高也會(huì)降低其生物活性，甚至完全失活。因此，在檢測過程中對溫度的控制則顯得非常重要，國標(biāo)要求植酸酶活性測定時(shí)的溫度為（37±0?1）°C。在33°C吋植酸酶不能很好地發(fā)揮其活性，酶活與其真實(shí)值相比約低10%；在40°C時(shí)，部分植酸酶會(huì)失活，酶活與其真實(shí)值相比約低8%。另外，水浴加熱時(shí)，水浴液面要超過試管內(nèi)反應(yīng)液液面，使其在規(guī)定時(shí)間內(nèi)充分反應(yīng)。2pH值pH值在酶活測定吋影響很大，國標(biāo)要求pH值為5.5。當(dāng)pH值為3.0時(shí)，植酸酶活力基本消失。盡量不耍用酸度計(jì)來調(diào)節(jié)緩沖液的pH值，因?yàn)樗岫扔?jì)存在一定的誤差，使用時(shí)間長了會(huì)發(fā)生鈍化，使測定

4、的pH值不準(zhǔn)?？梢酝ㄟ^計(jì)算緩沖溶液屮H+濃度的方法來配制一定pH值的溶液。如①配制0.25mol/l乙酸緩沖液，加入34.02g三水乙酸鈉、2.78ml濃鹽酸，完全溶解后定容至1000ml,用精密pH試紙測定溶液pH值為5.0。筆者曾用酸度計(jì)對照，配制上述pH值溶液需加入濃鹽酸6ml,1：3鹽酸約20ml,此溶液pH值實(shí)際上已經(jīng)低于5.0,由此說明此酸度計(jì)已經(jīng)反應(yīng)遲鈍。②配制0.25mol/kpH值5.50的乙酸緩沖液，需加入34.02g三水乙酸鈉、1.24ml濃鹽酸，完全溶解后定容至1000ml,用精密pH試紙測定溶液pH值為5.50o3底物植酸鈉的型號(hào)

5、植酸鈉有兩種型號(hào)，一種是Sigmap-3168,分了量為923.8；另一種是Sigmap-8810,分子量為660.03。根據(jù)國標(biāo)要求，植酸鈉應(yīng)為Sigmap-3168,筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Sigmap-3168植酸鈉底色淺,且作磷標(biāo)準(zhǔn)曲線吋梯度較好（見表1、表2）o表】以Sign-iap-3]68為慮觀不同璘濃度對媒龍度的夥響臓度（ruru口1"）2512.56.253.1251.5625吸光度0.7^903930.2000.0350.036由表1、表2可以看出檢測植酸酶活性時(shí)用Sigmap-3168為反應(yīng)底物較好。耒2嘆Sigmap-S8]O為慮物不同璘濃

6、?虞對披龍虞的夥響暁濃度（亦口VI）2512.56.253.1251.5625吸光度03740.1760.0740.0304離心速度和時(shí)間當(dāng)水浴30min終止酶解反應(yīng)后，需要進(jìn)行離心。國標(biāo)要求4000r/min,離心lOmin。若以3000r/min離心lOmin,則離心不徹底,測吸光度時(shí)發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度不呈梯度；以5OOOr/min離心lOmin時(shí),發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線各梯度的吸光度與以4OOOr/min離心lOmin時(shí)相比偏低。如果應(yīng)用國標(biāo)改進(jìn)法，乙酸緩沖液中加入了牛血清白蛋口，離心吋間需要15mino筆者曾用國標(biāo)改進(jìn)法進(jìn)行了吋間對比實(shí)驗(yàn)，測定酶活時(shí)離心lO

7、min和15min后樣品的吸光度（見表3）。表3不同飄心時(shí)間對杭酸晦檢糾結(jié)杲的夥響頃目寫詢間（ruin）吸光度測宦結(jié)果（15一訓(xùn)酸翻100J31033150.112306二導(dǎo)檢酸酸100.0259415OJ337246由表3可見，離心時(shí)間對測定結(jié)果影響很大。5公式換算在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中即使做得再成功，若公式換算出錯(cuò)，將會(huì)前功盡棄。植酸酶絕對法測定酶活時(shí)，計(jì)算公式如下：植酸酶活性（LVg）=njx30式中：C——根據(jù)實(shí)際樣液的吸光值由曲線刨歸方程計(jì)算出的y值(U)；F——試樣溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù)；m試樣質(zhì)量（g）；30——反應(yīng)時(shí)間（min）o其中F所代表的總

8、稀釋倍數(shù)換算吋容易出現(xiàn)錯(cuò)誤，現(xiàn)在我們舉例說明：稱取500IU植酸酶