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《人源gm-csf、il-4基因串聯(lián)共表達(dá)重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、萬方數(shù)據(jù)目錄中文摘要?????????????????????????????¨1英文摘要???????????????????????????3符號說明???????????????????????????????5前言?????????????????????????????????????·1／日IJ舌?????????????????????????????????????。第一部分???????????????????????????12材料與方法????????????????????????13結(jié)果??????????????????????????????????
2、35討論??????????????????????????????????36結(jié)論??????????????????????????????????38第二部分???????????????????????????·39材料與方法????????????????????????40結(jié)果??????????????????????????????????52結(jié)論??????????????????????????????????58附圖??????????????????????????????????59參考文獻(xiàn)???????????????????????????-62烏宗
3、述???????????????????????????????????一·66萬方數(shù)據(jù)致{射????????????????????????????????????一73攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文?????????????????．74原創(chuàng)性聲明?????????????????????????。75萬方數(shù)據(jù)泰山醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文人源GM-CSF、IL一4基因串聯(lián)共表達(dá)重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá)研究生：殷殷專業(yè)：病原生物學(xué)導(dǎo)師：于愛蓮教授王玉副教授中文摘要目的本課題以人白細(xì)胞介素一4(白介素一4，Interleukin-4，IL一4)，粒細(xì)胞一巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granuloc
4、yte—macrophagecolonystimulatingfactor，GM—CSF)為模型細(xì)胞因子，建立并優(yōu)化人源性細(xì)胞因子的組合，并在真核細(xì)胞中穩(wěn)定性表達(dá)重組蛋白及其活性研究，這為多細(xì)胞因子在體外能夠共同表達(dá)提供了實(shí)驗(yàn)素材和理論參考。構(gòu)建人GM—CSF、IL一4基因各自獨(dú)立和經(jīng)IRES元件串聯(lián)的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pGM—CSF、plL一4和pGM—CSF—IRES—IL-4，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并經(jīng)過連接免疫熒光(indirectimmunofluorescenceassay，IFA)及酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme．1inkedimmunosorbentassay，Elisa)檢測其
5、表達(dá)活性，為構(gòu)建永久表達(dá)細(xì)胞系做準(zhǔn)各，同時(shí)人源細(xì)胞因子的體外表達(dá)及其誘生DC／CIK培養(yǎng)試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。方法1．引物和質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與合成依據(jù)GenBank上已經(jīng)公布了的人源性GM-CSF、IL．4基因的參考序列。分別設(shè)計(jì)了附加酶切位點(diǎn)的引物，酶切位點(diǎn)為XhoI、BglII和SalI、MluI，以及質(zhì)粒pMDl5一T—CSF、pMDl5一T—IL一4。2．重組質(zhì)粒pGM—CSF、plL-4、pGM—CSF．IRES—IL一4的構(gòu)建經(jīng)PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒pMDl5一T-CSF、pMDl5一T．IL．4中的目的片段GM—CSF、IL-4；利用0．8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收、瓊脂糖凝
6、膠回收純化好的的PCR產(chǎn)物，分別在各自的酶切位點(diǎn)處進(jìn)行雙酶切，目的是回收兩條目的基因片段GM—CSF和IL一4；用T4連接酶分別與經(jīng)同步酶切的載體片段lasT—ASG上進(jìn)行連接，經(jīng)在固體培養(yǎng)皿上長出的優(yōu)勢抗性菌落的常規(guī)篩選，構(gòu)建單獨(dú)表達(dá)GM．CSF、IL一4基因的重組質(zhì)粒pGM—CSF、plL一4：將目的基因與連接片段IRES分步連接到PsT．ASG載體】萬方數(shù)據(jù)泰山醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文上，經(jīng)在固體培養(yǎng)皿上長出的優(yōu)勢抗性菌落的常規(guī)篩選，構(gòu)建pGM—CSF—IRES—IL一4真核表達(dá)載體。3．重組質(zhì)粒pGM—CSF、plL一4、pGM—CSF—IRES—IL一4在CHO細(xì)胞中的瞬時(shí)表
7、達(dá)將重組質(zhì)粒pGM—CSF、plL一4、pGM—CSF—IRES-IL一4在陽性脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，24小時(shí)后檢測GM—CSF、IL一4在CHO細(xì)胞中的表達(dá)。4．1FA及Elisa檢測表達(dá)情況對轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞用IFA和Elisa檢測人源GM—CSF、IL-4基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果1．真核表達(dá)質(zhì)粒pGM—CSF、pIL一4、pGM．CSF．IRES—IL-4的構(gòu)建成功構(gòu)建的三種真核表達(dá)質(zhì)粒pGM—CSF、plL一4和pGM—CSF—IRES—IL-4，分別在經(jīng)菌落PCR
