體外心肌樣微環(huán)境誘導(dǎo)p19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化

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2、的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注等內(nèi)容外，文中不包含其他人已發(fā)表或撰寫的研究成果，指導(dǎo)教師對此進行了審定。本論文由本人獨立撰寫，文責(zé)自負(fù)。堿蝴轢蠅刷謐氧如“年廠月仰日＼刪目錄中文摘要?????????????????????????．．1英文摘要?????????????????????????．．4研究論文體外心肌樣微環(huán)境誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化前言??????????????????????????8日U舌???．??????????????????????．．8材料與方法?????????

3、?????????????．．9結(jié)果?????????????????????????．17附圖?????????????????????????20附表?????????????????????????．30討j淪?????????????????????????．32結(jié)論?????????????????????????．34參考文獻???????????????????????35綜述P19細(xì)胞心肌定向分化的方法及其機制?????????．37致謝???????????????????????

4、?????50個人簡歷?????????????????????????51中文摘要體外心肌樣微環(huán)境誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化摘要一般認(rèn)為成熟的心肌細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，無生長和繁殖能力，因心肌梗死而損傷的心肌組織也就不能得到修復(fù)，由此造成心肌細(xì)胞數(shù)量下降，是引起心力衰竭等心臟疾病的重要原因。目前細(xì)胞移植為病損心肌細(xì)胞的修復(fù)提供了一種全新的治療方案。有學(xué)者提出用骨骼肌細(xì)胞代替心肌細(xì)胞，但是研究發(fā)現(xiàn)：移植骨骼肌細(xì)胞可能會使部分患者患上嚴(yán)重的心律不齊并導(dǎo)致患者的死亡。胚胎干細(xì)胞的成功分離，為壞死心肌細(xì)胞

5、的修復(fù)帶來了希望。胚胎干細(xì)胞是“全能’’的細(xì)胞，可以分化為人體所有種類的細(xì)胞。因此，理論上講，在適當(dāng)?shù)臈l件下，胚胎干細(xì)胞可以分化為心肌細(xì)胞。近年來，不少研究致力于探討誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的條件。目前認(rèn)為，干細(xì)胞進入微環(huán)境后會對相應(yīng)的各種物理或化學(xué)信號做出反應(yīng)，即環(huán)境誘導(dǎo)分化。多種細(xì)胞的體內(nèi)外分化研究表明，體內(nèi)心肌環(huán)境或體外“心肌樣”環(huán)境比單純的化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)更為重要。鑒于此，本實驗應(yīng)用P19細(xì)胞與乳鼠心肌細(xì)胞進行直接接觸培養(yǎng)或用～心肌樣”環(huán)境條件培養(yǎng)P19細(xì)胞，運用形態(tài)學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)，

6、研究P19細(xì)胞在心肌環(huán)境中的生長、分化狀態(tài)，探討環(huán)境因素對P19細(xì)胞分化的作用及分化機制，為P19細(xì)胞體內(nèi)分化機制及細(xì)胞移植的研究奠定基礎(chǔ)。一P19細(xì)胞傳代及懸浮培養(yǎng)P19細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇傳代培養(yǎng)，取傳代4代以上的P19細(xì)胞，以5×105／mL密度接種在鋪有低熔點瓊脂的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)4天，形成細(xì)胞聚集體EBs(emb巧onicbodies，EBs)。用倒置顯微鏡觀察P19細(xì)胞生長分化情況，以及懸浮培養(yǎng)4天后形成EBs的情況。結(jié)果顯示：P19細(xì)胞傳代后約2h開始貼壁生長，細(xì)胞呈圓形，24h后長滿瓶底的50

7、％左右，細(xì)胞呈扁平不規(guī)則形，48h細(xì)胞生長密集。P19細(xì)胞在鋪有低熔點瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)48h后，細(xì)胞聚集形成細(xì)胞團，較均勻規(guī)則，懸浮生長。至第4天形成球形EBs。二乳鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定取出生1．3天的SD大鼠乳鼠，75％酒精消毒皮膚，開胸取出心室肌中文摘要組織剪成1mm3的小塊，用胰酶和EDTA消化，直至組織消化完全，收集消化液過濾、離心、重懸后，通過差速貼壁一次和加入O．1mm01／LBrdU來純化心肌細(xì)胞。48h后換去含BrdU的培養(yǎng)基，以后隔天換液，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞變化。

8、培養(yǎng)3天后心肌細(xì)胞呈梭形、多角形等不規(guī)則形態(tài)，伸出突起相互連接交織成網(wǎng)，并出現(xiàn)成片同化搏動，頻率多為60．120次／分。cTnT抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示：心肌細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色絲狀結(jié)構(gòu)。心肌細(xì)胞純度鑒定：乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)72h，cTnT陽性率為70％。三體外心肌微環(huán)境定向誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化1P19細(xì)胞和乳鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)用BrdU標(biāo)記P19細(xì)胞，BrdU標(biāo)記濃度為15“mol／L，標(biāo)記時間為48h，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：細(xì)胞核標(biāo)記為棕黃色，陽性率為50％。