小麥持久抗條銹品種里勃留拉抗條銹基因的分子標(biāo)記

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甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文2．2．2非整倍體法非整倍體法主要是應(yīng)用單體分析法將抗病基因定位在染色體上。單體分析是普通小麥基因定位的最常用方法，具體步驟為：分別以21個(gè)單體為母本，與被檢測(cè)的抗病品種雜交，用對(duì)抗病品種無(wú)毒性的病原菌單孢菌系接種鑒定各雜交組合的雜種Fl單體植株和來(lái)自Fl單體植株的F2代群體，根據(jù)其抗性分離表現(xiàn)確定抗性基因所在的染色體。自1954年美國(guó)人Sears應(yīng)用小麥品種中國(guó)春成功地創(chuàng)造出所有可能的21種單體、缺體、三體和四體小麥非整倍體材料，人們就立即應(yīng)用其為小麥抗病基因的研究提供依據(jù)。利用非整倍體小麥作為研究工具，可以將目的基因準(zhǔn)確地定位于染色體乃至染色體臂上。單體分析是普通小麥基因定位的最常用方法，具體步驟為：分別以21個(gè)單體為母本，與被檢測(cè)的抗病品種雜交，用對(duì)抗病品種無(wú)毒性的病原菌單孢菌系接種鑒定各雜交組合的雜種Fl單體植株和來(lái)自Fl單體植株的F2代群體，根據(jù)其抗性分離表現(xiàn)確定抗性基因所在的染色體。1959年印度的Swaminathnan首次用單體分析了小麥品種Klein．cometa的抗條銹性遺傳，定位了三個(gè)隱性基因，它們分別分布在4，6，9染色體上【8】。Sears繼續(xù)創(chuàng)建了整套的小麥雙端體，通過(guò)端體分析可將基因進(jìn)一步定位在某一染色體臂上，并測(cè)定基因與著絲粒的遺傳距離。之后，人們應(yīng)用該方法不斷取得成果，目前已成功地將已正式命名的31個(gè)Yr基因中的26個(gè)定位在染色體或染色體臂上。非整倍體法可將基因定位于不同染色體上，結(jié)果可靠，但對(duì)于一個(gè)品種中包括有幾個(gè)基因而這些基因間連鎖或具有其它相互作用關(guān)系時(shí)，該方法難以應(yīng)用。同時(shí)該方法必需具有一整套非整倍體系統(tǒng)。2．2．3基因推導(dǎo)法基因推導(dǎo)分析方法是以經(jīng)典分析和非整倍體分析為基礎(chǔ)，以一套抗銹單基因系或已知基因品種作為標(biāo)準(zhǔn)品種，接種一系列已知毒性基因或基因組合的銹菌菌系，比較待測(cè)品種與標(biāo)準(zhǔn)品種相對(duì)應(yīng)的侵染型組合，推導(dǎo)其是否具有與標(biāo)準(zhǔn)品種相同的抗銹基因和基因組合。Browder(1985)19】提出了初步的抗病基因推導(dǎo)方法，并應(yīng)用13個(gè)抗葉銹近等基因系在5個(gè)重要品種中推導(dǎo)出Lrl和LrlO兩個(gè)基因。牛永春等Ilo】利用該方法推導(dǎo)豫、魯、皖三省50個(gè)重要小麥生產(chǎn)品種所具有的抗條銹基因，發(fā)現(xiàn)Yr9所占比例最大，其次為Yr2、y，J基因。Loegering【11—2】等利用該方法對(duì)69個(gè)品種的抗病基因進(jìn)行了推導(dǎo)并指出結(jié)果對(duì)育種有用。但隨后Ready指出，這種方法不能鑒定出互補(bǔ)基因，反而會(huì)引起品種中含有累加基因而造成混亂(郭愛(ài)國(guó)，1993)：Johnson指出，4 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文該方法必須結(jié)合系譜進(jìn)行分析，否則容易出錯(cuò)。Dubin在前人工作基礎(chǔ)上完善了基因推導(dǎo)法則，提出了抗病基因推導(dǎo)的六條原則【131。朱桂清等114】根據(jù)Statler基因推導(dǎo)方法設(shè)計(jì)出計(jì)算機(jī)程序用來(lái)推導(dǎo)小麥抗銹基因，這就進(jìn)一步簡(jiǎn)化了基因推導(dǎo)方法且大大加快了分析速度。該學(xué)說(shuō)對(duì)于揭示寄主抗病基因與病菌致病基因相互作用的關(guān)系、監(jiān)測(cè)病菌生理小種變化動(dòng)態(tài)、指導(dǎo)抗銹基因的合理利用、培育抗病品種起到了重要作用?；蛲茖?dǎo)法快速簡(jiǎn)便，一次性檢測(cè)品種量大，能在4"-8周了解常規(guī)雜交方法需要2．-一3年才能得到的遺傳信息。然而該方法也存在一定的不足?；蛲茖?dǎo)不適于鑒定成株抗性，并且其準(zhǔn)確性易受溫度、供試培養(yǎng)物、鑒別能力和人為因素的影響。也沒(méi)有考慮基因之間存在的相互作用，寄主或病原物基因型的雜合性以及遺傳背景等因素的影響，在應(yīng)用上有很大的局限性。該方法不論怎樣發(fā)展，僅僅是一種假說(shuō)，不能代替常規(guī)遺傳分析。2．2．4分子標(biāo)記技術(shù)分子標(biāo)記是指生物基因組DNA經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增或兩者結(jié)合等措施處理后電泳，檢測(cè)到的反映基因組某種變異特征的特異性DNA片段。在真核生物中，基因組中存在著大量的不編碼DNA序列，它們的變異不受或較少受自然選擇的制約，因此，分子水平上的多態(tài)性較高。目前在小麥分子標(biāo)記研究中，應(yīng)用較多的是RFLP、RAPD、SSR和AFLP技術(shù)。分子標(biāo)記是傳統(tǒng)遺傳標(biāo)記的補(bǔ)充和發(fā)展，但與傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記相比，分子標(biāo)記技術(shù)具有其獨(dú)特的優(yōu)越性：(1)直接以DNA的形式表現(xiàn)，在植物的各個(gè)組織、各器官以及各個(gè)發(fā)育時(shí)期均可檢測(cè)到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，也不存在表達(dá)與否的問(wèn)題，有很高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。(2)分子標(biāo)記數(shù)量多，遍及整個(gè)基因組，檢測(cè)位點(diǎn)幾乎無(wú)限，這是形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記所無(wú)法比擬的。(3)多態(tài)性高，自然存在的許多等位變異，不需專(zhuān)門(mén)創(chuàng)造特殊的遺傳材料。(4)分子標(biāo)記不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，表現(xiàn)為“中性”，與不良性狀無(wú)必然的連鎖。(5)分子標(biāo)記大部分表現(xiàn)為共顯性，能夠鑒別出純合基因型與雜合基因型，提供完整的遺傳信息【15，161。這些特點(diǎn)使分子標(biāo)記技術(shù)已成為當(dāng)今最理想的遺傳標(biāo)記，也決定其能得到迅速5 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文發(fā)展和廣泛應(yīng)用。目前分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種選擇(MAS)、指紋圖譜構(gòu)建等方面。這四種小麥抗條銹基因分析方法的特點(diǎn)見(jiàn)表2。表2幾種不同研究方法的特點(diǎn)比較Table2Comparisonofdifferentresearchingmeans3分子標(biāo)記的應(yīng)用3．1分子標(biāo)記在小麥抗條銹研究中的應(yīng)用20世紀(jì)80年代以來(lái)，分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，使分子標(biāo)記技術(shù)成為繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記之后的一種新的遺傳標(biāo)記。與過(guò)去人們利用的表型標(biāo)記、生化標(biāo)記相比，分子標(biāo)記因不受環(huán)境影響、多態(tài)性高、數(shù)量大、顯性及不影響生物性狀表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用?？共』蚴窃S多植物育種項(xiàng)目和遺傳圖譜研究的重要目標(biāo)，傳統(tǒng)的基因定位追蹤困難、周期長(zhǎng)。利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)可對(duì)與抗病基因連鎖的基因組區(qū)域進(jìn)行分析，鑒定染色體上特異的DNA片段，找出與抗病基因連鎖的分子標(biāo)記，進(jìn)而確定其在染色體上的位置，大大提高抗病育種的效率，為以標(biāo)記為基礎(chǔ)的選擇和分離抗病基因打下基礎(chǔ)【17】。目前，在小麥抗條銹研究中利用較多的分子標(biāo)記有：I疆LP、RAPD、SSR和AFLP。3．1．1限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記RFLP(restrictionfrgmentlengthpolymorphism)，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，作為遺傳分析的工具開(kāi)始于1974年，從80年代開(kāi)始應(yīng)用于植物。是較早被廣泛應(yīng)用的一類(lèi)分子標(biāo)記。是以Southern雜交技術(shù)為核心的一類(lèi)分子標(biāo)記。產(chǎn)生RFLP的分子基礎(chǔ)是DNA中特定酶切位點(diǎn)上堿基對(duì)的變異，反映了DNA序列中核苷酸排列順序的差異性。DNA在限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生單位堿基突變、結(jié)構(gòu)重排及甲基化等，6 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文均可導(dǎo)致限制性片斷長(zhǎng)度的多態(tài)性。只要限制性酶選擇得當(dāng)，均可鑒定到DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。Autrique等㈣利用普通小麥與人工合成六倍體小麥雜交的單粒傳F7世代的114個(gè)株系，把抗條銹病基因Yrl8定位于7D染色體的短臂。Sun[191等以NILs為材料，利用RFLP技術(shù)對(duì)來(lái)自野生二粒小麥的抗條銹基因Yrl5進(jìn)行定位，找到了1個(gè)RFLP標(biāo)記Norl，遺傳距離為11cM。Peng等【20】建立了Yrl5、YrH52的RFLP標(biāo)記Norl，遺傳距離分別為2．6cM和2．0cM。由于小麥RFLP多態(tài)性低，而且該技術(shù)對(duì)DNA多態(tài)性檢測(cè)的靈敏度不高，RFLP連鎖圖上還有很多大的空間區(qū)，而且周期長(zhǎng)、程序復(fù)雜，通常要使用放射性物質(zhì)。因此限制了RFLP技術(shù)在小麥上的應(yīng)用。3．I．2隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)，是由Williams等【2n、Welsh和Mccelland【22】分別發(fā)展起來(lái)的一種分子標(biāo)記技術(shù)。RAPD是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)，以單一的10堿基隨機(jī)引物對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生不連續(xù)產(chǎn)物(通?？蓹z測(cè)到5"-'9條帶)經(jīng)染色后即可鑒定多態(tài)性。這些多態(tài)性是由引物結(jié)合位點(diǎn)的突變引起的，或由引物結(jié)合序列之間的差異產(chǎn)生的，屬于顯性標(biāo)記。Olivert231篩選到與Yrl7連鎖的RAPD標(biāo)記OPYl5．580，并將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記SC．Yrl5。牛永春等【24】用普通小麥Lee與“Taichun929’’及“銘賢169”為材料，采用近等基因系(NIL)的方法找到了與抗條銹基因YrLee連鎖的特異性片段OPR．7，其長(zhǎng)度約為465bp。Sun等【25】采用近等基因系，利用340個(gè)引物擴(kuò)增出6個(gè)多態(tài)性核苷酸片斷，其中一個(gè)片斷OPB13．1420與抗病基因連鎖，然后利用順序OPB13．1420．Yr15-Nor1將Yrl5基因定位在染色體1B上。Chague等t26j倉(cāng),j建了與Yrl5連鎖遺傳距離約5cM的RAPD標(biāo)記UBC199．700，與標(biāo)記OPBl3．1420(遺傳距離27．1cM)相比，其連鎖程度更為緊密。RAPD技術(shù)沒(méi)有物種特異性的限制，對(duì)DNA質(zhì)量要求不高，操作簡(jiǎn)便，但其重復(fù)性、可靠性差，通常需要將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高的SCAR、STS標(biāo)記。但其的最大缺點(diǎn)是穩(wěn)定性及可重復(fù)性差。為提高擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和穩(wěn)定性，有人提出將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR(SequenceCharacterizedAmplifiedRegion)標(biāo)記，可獲得較好的效果。SCAR標(biāo)記具有更高的重現(xiàn)性，通常是共顯性遺傳。7 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文3．1．3簡(jiǎn)單序列重復(fù)SSR(simplesequencerepeats)簡(jiǎn)單序列重復(fù)，又稱(chēng)微衛(wèi)星DNA，所有真核基因組中均含有一類(lèi)DNA堿基序列，被稱(chēng)為微衛(wèi)星【271它是由一類(lèi)1-6個(gè)堿基組成的基因序列串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長(zhǎng)度一般較短，不同等位基因間的重復(fù)數(shù)存在豐富的差異，因而是許多真核基因組中普遍存在的遺傳標(biāo)記來(lái)源【281。微衛(wèi)星DNA廣泛分布于真核生物基因組中，大約每隔分子長(zhǎng)10---50bp就有一個(gè)微衛(wèi)星DNA，由于微衛(wèi)星核心序列重復(fù)次數(shù)和重復(fù)程度的不完全而造成每一個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性，但微衛(wèi)星DNA兩端的序列多是保守的單拷貝序列。尋找其中的特異保守區(qū)，由此設(shè)計(jì)l對(duì)位點(diǎn)專(zhuān)一的引物，利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增每個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星DNA序列，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離(或聚丙烯酰胺凝膠電泳)，當(dāng)利用1對(duì)引物擴(kuò)增不同基因型中的SSR位點(diǎn)時(shí)，可檢測(cè)出SSR核心序列的長(zhǎng)度多態(tài)性即為SSR標(biāo)記。在小麥基因組中，重復(fù)序列可以占到其總量的83％1291。SSR較早應(yīng)用于人類(lèi)和哺乳動(dòng)物的研究，在主要的栽培作物中SSR的分布也非常豐富，在大豆、水稻、擬南芥、大麥、小麥等植物中SSR均比RFLP的多態(tài)性高。在小麥中，SSR已被證實(shí)是一種非常有效的分子標(biāo)記。Roder等【30】在1998年構(gòu)建了包含279個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的小麥微衛(wèi)星圖譜，為小麥目的基因的定位和標(biāo)記建立，特別是已知基因的標(biāo)記建立提供了極大的方便。Peng等【31】利用SSR標(biāo)記技術(shù)獲得3個(gè)與抗病基因YrH52連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記，其中標(biāo)記Xgwm413、Xgwm273a與YrH52的遺傳距離分別為1．3和2．7cM。Bomer等【32】在Lgst79．74上獲得一個(gè)距離Yms．B1基因21cM的SSR引物Xgwm493。Plaschke等【33】用23個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)40份歐洲小麥品種進(jìn)行檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)142個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每個(gè)SSR標(biāo)記能檢測(cè)到6．2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。馬漸新等【34】篩選到兩個(gè)與小麥抗銹病基因Yr26連鎖的SSR標(biāo)記XgwmJJ以8、Xgwm413，遺傳距離分別為1．9cM和3．2cM，并將該基因定位在1BS上。林鳳等【35J以近等位基因系Taichun929*6／HeinesVII與感病的背景親本Taichun929構(gòu)建F2分離群體，篩選出一個(gè)與小麥抗條銹病基因Yr2緊密連鎖的SSR標(biāo)記WMC364．207bp／201bp，其與Yr2基因之間的遺傳距離為5．6eM。SSR標(biāo)記具有RAPD標(biāo)記的所有優(yōu)點(diǎn)，且多態(tài)性豐富，克服了RAPD的缺點(diǎn)【361，具有較高的穩(wěn)定性、遺傳上呈共顯性、DNA用量小、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好‘37，38·391，是進(jìn)行品種指紋分析、研究目的基因連鎖關(guān)系和構(gòu)建遺傳圖譜的理想標(biāo)記，但要獲得SSR引物需要進(jìn)行大量克隆、測(cè)序和雜交驗(yàn)證工作。目前已經(jīng)在小麥基因組作圖、小麥種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、構(gòu)建小麥指紋圖譜、小麥品系鑒定和基因診斷等研8 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文究領(lǐng)域展示出較大的應(yīng)用潛力。3．1．4擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性AFLP(AmplifideFragmentLengthPolymorphisms)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性是1993年由荷蘭KeyGen公司的科學(xué)家Zabeau等【401發(fā)現(xiàn)，并有Vos等【411發(fā)展起來(lái)的一種新的DNA指紋技術(shù)。其基本原理是利用兩種或兩種以上的限制性?xún)?nèi)切酶切割基因組DNA，形成不同酶切位點(diǎn)的限制性酶切片段，在所得的酶切片段上加上雙鏈人工接頭，作為PCR擴(kuò)增的模板。引物由3部分組成：從5’．3’依次為與人工接頭互補(bǔ)的核心堿基序列、限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列、3’端選擇堿基序列。3’端選擇堿基的種類(lèi)、數(shù)目、順序決定了PCR特殊性，使酶切片段被選擇性擴(kuò)增。在AFLP中，如果DNA片段遺傳特性發(fā)生改變，酶切片段數(shù)目、長(zhǎng)度發(fā)生變化，在測(cè)序膠的電泳圖譜上就會(huì)顯示出多態(tài)性。既有RFLP技術(shù)的可靠性，又有PCR技術(shù)高效靈敏等特點(diǎn)。Peng等【42】建立了20個(gè)與抗條銹基因YrH52連鎖的AFLP標(biāo)記，顯著增加了該基因周?chē)臉?biāo)記密度。Smith等【43】人利用AFLP技術(shù)對(duì)Yrl、Yr5、Yr7進(jìn)行定位研究，并將所得標(biāo)記用于鑒定紛基因缺失突變體。邵映田等m】篩選到一個(gè)與YrlO基因連鎖的AFLP標(biāo)記PT0502，并將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記SC200，遺傳距離僅為0．5cM。鄧志勇和曹張軍【45J采用AFLP技術(shù)并結(jié)合SSR方法對(duì)普通小麥材料Qzl80中的一個(gè)未知的抗條銹病基因和一個(gè)來(lái)自華山新麥草的新的抗條銹病基因進(jìn)行了分子標(biāo)記定位，為這些抗源材料和抗病基因的進(jìn)一步利用奠定了基礎(chǔ)。AFLP實(shí)質(zhì)是RFLP和PCR技術(shù)的結(jié)合，既結(jié)合了RFLP的穩(wěn)定性和PCR技術(shù)的高效性，同時(shí)又避免了RFLP受探針限制的因素，方便快速，只需少量DNA，而且受模板濃度的影響比較小，不需要預(yù)先知道DNA的序列信息，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，可以快速獲得大量信息，因而可以產(chǎn)生豐富而穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記。目前，AFLP技術(shù)已經(jīng)被成功地應(yīng)用于小麥種質(zhì)資源研究中。3．1．5各種分子標(biāo)記在小麥抗病基因研究中的優(yōu)缺點(diǎn)在上述4種分子標(biāo)記中，RFLP是應(yīng)用比較普遍的一種，其穩(wěn)定性較好，目前絕大多數(shù)分子遺傳圖譜都是用RFLP分子標(biāo)記構(gòu)建的，但是由于RFLP在小麥品種(系)內(nèi)品種(系)間本身的多態(tài)性低，且操作技術(shù)復(fù)雜，成本高，需要接觸放射性同位素，從而限制了RFLP在小麥中的廣泛應(yīng)用。分子標(biāo)記技術(shù)RAPD是方便經(jīng)濟(jì)的分子標(biāo)記，操作簡(jiǎn)單，引物通用，檢測(cè)位點(diǎn)多，但是其重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，況且RAPD在小麥中檢測(cè)的多態(tài)性?xún)H僅能與RFLP相比。AFLP的綜合信息量大，9 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文在作物特別是小麥遺傳資源的研究上有著廣闊的應(yīng)用前景，但其技術(shù)較復(fù)雜，需要同位素操作，受專(zhuān)利保護(hù)，因而使得這種分子標(biāo)記技術(shù)在小麥種質(zhì)遺傳研究中的應(yīng)用受到一定限制。分子標(biāo)記技術(shù)SSR操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，其具有較高的多態(tài)性、共顯性分離、位點(diǎn)轉(zhuǎn)化性、標(biāo)記覆蓋整個(gè)基因組、分布均勻、DNA樣本用量少等優(yōu)點(diǎn)M。比RFLP和PAPD標(biāo)記更能有效的揭示遺傳多樣性，特別適用于其它類(lèi)型標(biāo)記所揭示變異水平低的物種，SSR不僅能有效地進(jìn)行品種鑒定，而且能較好地揭示品種間的親緣關(guān)系1471。大量研究表明，SSR標(biāo)記是研究小麥種質(zhì)遺傳資源的有效分子標(biāo)記之一【48“91。RFLP、RAPD、SSR、AFLP分子標(biāo)記的特點(diǎn)詳見(jiàn)表3。表3RFLP、RAPD、SSR、AFLP分子標(biāo)記的比較Table3ComparisonofthemolecularmarkersRFLP,RAPD，SSR，ISSR，AFLP3．2分子標(biāo)記輔助選擇育種分子標(biāo)記輔助選擇育種(Molecularmarker-assistedselection，簡(jiǎn)稱(chēng)MAS)是現(xiàn)代分子生物學(xué)與傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合的新育種方式和手段。借助分子標(biāo)記可以對(duì)育種材料從DNA水平上進(jìn)行選擇，從而達(dá)到作物綜合性狀的高效改良【50】。通過(guò)分子標(biāo)記輔助的回交轉(zhuǎn)育可以減少回交次數(shù)和回交群體，理論上只要回交3代就可選到10 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文理想的材料。因此，分子標(biāo)記輔助選擇育種可以快速明確育種目標(biāo)，累積目標(biāo)基因，提高育種選擇效率，從速度、效率和方便的角度考慮，以PCR為基礎(chǔ)的MAS受到人們的普遍重視。由于作物新品種選育涉及質(zhì)量性狀及數(shù)量性狀兩個(gè)方面，從而決定分子標(biāo)記輔助選擇育種在作物育種上的應(yīng)用主要包括如下三個(gè)方面：(1)分子標(biāo)記輔助選擇育種在回交育種中的應(yīng)用?；亟挥N對(duì)帶有個(gè)別不良性狀的品種改良是一種較好的選育途徑，由于利用分子標(biāo)記既可以鑒別目標(biāo)基因(即前景選擇)，又可對(duì)輪回親本基因組進(jìn)行選擇(即背景選擇)，因此分子標(biāo)記輔助選擇用于回交轉(zhuǎn)育可以提高選擇效率，加快育種進(jìn)程。用分子標(biāo)記輔助選擇可以快速有效的選出帶有目的基因的單株，以輪回親本基因組為遺傳背景的單株以及與目標(biāo)基因附近發(fā)生重組交換的個(gè)體。(2)分子標(biāo)記輔助選擇在基因聚合中的應(yīng)用?；蚓酆鲜菍⒍鄠€(gè)有利基因通過(guò)選育途徑聚合到一個(gè)品種之中，這些基因可以控制相同的性狀，也可以控制不同的性狀，基因聚合突破了回交育種改良個(gè)別性狀的局限，使品種在多個(gè)性狀上同時(shí)得到改良，創(chuàng)造更有實(shí)用價(jià)值的育種材料。基因聚合常用于抗性育種中，育種專(zhuān)家將多個(gè)控制垂直抗性的基因聚合在同一品種中，可以提高作物抗病的持久性。(3)分子標(biāo)記輔助選擇在數(shù)量性狀改良中的應(yīng)用。育種實(shí)踐證明，分子標(biāo)記輔助選擇為傳統(tǒng)的育種提供一種有力的輔助手段。劉志勇等【5l】對(duì)小麥抗葉銹基因Lr9，Lr24進(jìn)行了分子標(biāo)記診斷，結(jié)果在17份材料中篩選出與Lr9基因連鎖的0．35kb的DNA片段。Tablertl52】等用與抗小麥條紋花葉病Wsml連鎖的RAPD標(biāo)記克隆測(cè)序后合成了轉(zhuǎn)化引物，該引物使Wsml的抗性在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行大批量早代選擇，進(jìn)而加速了Wsml導(dǎo)入生產(chǎn)品種的進(jìn)程。毛龍等【531應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)小麥一黑麥易位系中的抗條銹基因進(jìn)行了分析，篩選出OPE．12在易位系M8003中存在，而在栽培小麥中不存在，進(jìn)一步證明了分子標(biāo)記技術(shù)在雜交育種中檢測(cè)抗銹基因的價(jià)值。Robert(2000)t”J等人利用與Yrl7基因連鎖的SCAR標(biāo)記SC．Y15檢測(cè)面包小麥中的抗條銹基因Yrl7，并以表型檢測(cè)作對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，98％的被檢品系其標(biāo)記檢測(cè)與表型檢測(cè)一致。但仍有少量差異，推測(cè)原因可能是由于分子標(biāo)記與目標(biāo)基因之間的連鎖斷裂。盡管如此，隨著大量抗條銹基因分子標(biāo)記的不斷發(fā)掘及精確定位，標(biāo)記輔助選擇必將在常規(guī)抗條銹病育種中發(fā)揮愈來(lái)愈重要的作用。現(xiàn)階段分子標(biāo)記輔助選擇的應(yīng)用還存在一定的局限性：(1)目前的分子連鎖圖 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文譜幾乎全是用RFLP標(biāo)記構(gòu)建的，該標(biāo)記的成本較高，很難在植物育種領(lǐng)域普遍應(yīng)用，并且分子標(biāo)記篩選和應(yīng)用的費(fèi)用較高。因此，還需進(jìn)一步探索價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單的新的分子標(biāo)記。(2)標(biāo)記的基因數(shù)目非常有限，以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記數(shù)更少，因此還需進(jìn)一步構(gòu)建更為飽和的分子標(biāo)記連鎖圖譜。(3)對(duì)產(chǎn)量、抗逆等性狀的QTL分子標(biāo)記研究相對(duì)薄弱，因此還需進(jìn)一步對(duì)于控制數(shù)量性狀的數(shù)量基因或QTL進(jìn)行精確定位；(4)分子標(biāo)記鑒定工作主要集中抗性強(qiáng)的基因上，忽視了對(duì)一些小種已喪失抗性的基因的分子標(biāo)記鑒定，在有利基因標(biāo)記定位的速度仍較慢。分子標(biāo)記輔助育種可以大大縮短抗病育種的年限。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者致力于小麥抗病基因分子標(biāo)記的研究。小麥抗銹基因的分子標(biāo)記篩選始于20世紀(jì)90年代，應(yīng)用較多的是RFLP、RAPD、SSR、AFLP等，借助分子標(biāo)記技術(shù)，已找到了一些抗條銹基因的分子標(biāo)記(表4)。表4部分被標(biāo)記的小麥抗條銹病基因Table4Taggingofsomemajorstriperustgenesinwheat4小麥對(duì)條銹病抗性的研究4．1小麥對(duì)條銹病抗性的分類(lèi)所謂抗病性是指寄主植物與病原物之間相互作用所表現(xiàn)出來(lái)的抗病或感病的現(xiàn)象，是二者相互作用的結(jié)果。Vanderplank[55，56，571從群體遺傳學(xué)角度，根據(jù)寄主植12 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文物抗性變化和病原物變異的相關(guān)性，把植物抗病性分為垂直抗病性(verticalresistance)和水平抗病性(horizontalresistance)，他認(rèn)為垂直抗病性在遺傳上一般由單基因控制，而水平抗病性在遺傳上一般由多對(duì)或多個(gè)微效基因所控制，按照Vanderplank的觀點(diǎn)，在垂直抗病系統(tǒng)中，抗病性是相對(duì)的，是小種專(zhuān)化的，對(duì)于同一小種或株系而言，有的品種表現(xiàn)為感病，有的則表現(xiàn)為抗病；另一方面，一品種對(duì)此小種或茵系表現(xiàn)感病，對(duì)彼小種或菌株則表現(xiàn)抗病。而在水平抗病系統(tǒng)中，抗病性是非小種專(zhuān)化的，只有強(qiáng)弱之分，而無(wú)有無(wú)之別。Vanderplank的工作促進(jìn)了植物抗病性、遺傳基礎(chǔ)、利用方法等研究的深入發(fā)展。這個(gè)理論在植物病害流行學(xué)和抗病育種中仍具有十分重要的指導(dǎo)作用【5引。4．1．1垂直抗病性(verticalresistance)在生產(chǎn)上，這種抗性表現(xiàn)為高度抗病或免疫，由主效基因或寡基因控制。在這類(lèi)抗性基因中大部分屬于苗期抗性即全生育期抗性，只有少(Yrll。Yrl4,Yrl6,Yrl8等)屬于成株期抗性。小麥垂直抗病性基因的遺傳方式基本都屬于質(zhì)量性狀遺傳，大部分為顯性遺傳方式，少數(shù)表現(xiàn)為隱性遺傳方式，也有個(gè)別基因?qū)儆诎腼@性遺傳(如Frl8)。這類(lèi)抗病性容易觀測(cè)，并且在育種過(guò)程中容易操作，是目前主要的抗源材料，但這種抗性容易因小種發(fā)生變化而表現(xiàn)為感病，因而抗病性是不穩(wěn)定和不能持久的。目前，鑒定出的大部分抗條銹基因?qū)儆诖祟?lèi)。4．1．2水平抗病性(horizontalresistance)1963年Vandcrplank提出垂直抗性與水平抗性的概念，在植病和育種界引起很大震動(dòng)，但真正經(jīng)典的水平抗性可能只是理論上的概念。根據(jù)VanderPlank(1963)的定義【59J水平抗病性一般是由多基因即多個(gè)微效基因(minorgene)制的，也有由單基因控制的，這種抗性表現(xiàn)為中度抗病。水平抗病性的表現(xiàn)可因環(huán)境條件不同有較大差異，一般不會(huì)因小種區(qū)系的變化而改變，這種抗性對(duì)所有小種的反應(yīng)都一致，因此是穩(wěn)定和持久的。在這一方面國(guó)內(nèi)進(jìn)行了有益探索和研究，并提出了準(zhǔn)水平抗性概念和鑒定方法，但快速簡(jiǎn)便、可供育種學(xué)家實(shí)際采用的鑒定方法尚在研究中f60，6I】o4．2小麥持久抗條銹病的研究小麥條銹菌具有高度的寄生專(zhuān)化性和變異性，育成的抗病品種大面積種植后，常導(dǎo)致相應(yīng)的條銹菌致病小種的產(chǎn)生和危害，從而喪失抗性【62】。在條銹病常發(fā)易變區(qū)，小麥大部分抗病品種短則2～3年，長(zhǎng)則7～8年即由抗病變?yōu)楦胁　Ｆ贩N抗性保持時(shí)間短，已成為生產(chǎn)和育種上的一個(gè)突出問(wèn)題。自Johnson提出持久抗性的概 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文1鼉曼魯皇詈!曼曼曼!曼鼉詈詈蘭鼉魯皇皇曼鼉葛皇曼量量皇!曼鼉鼉喜量曼詈詈詈皇皇鼉曹鼉魯曹暑呂皇!曼量皇!詈皇皇曼!魯曼暑詈詈曼皇曙鼉!鼉寡皇!皇窟皇!毫曼曼鼉念后【“64]，有目的地選育與利用此類(lèi)品種已引起重視，并取得了進(jìn)展【6量66]。4．2．1持久抗病性的概念持久抗病性確切含義經(jīng)歷了由模糊、不確定到逐漸明確的過(guò)程。最初認(rèn)為這種抗性，泛指具有低水平的、正向的、明顯的侵染率的抗性。它對(duì)所有生理小種均有效，屬水平抗性，由多基因控制【6‘71。但具有這種抗病特點(diǎn)的品種抗病性很不穩(wěn)定，而具有持久抗性的品種在廣泛種植的條件下仍能保持良好抗性。鑒于上述事實(shí)，Johnson在1983年正式提出了持久抗性的概念【6引，這一概念從基本上統(tǒng)一了水平抗病性的不同概念。持久抗性確切的定義是指某些品種在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，在利于害病發(fā)生的環(huán)境條件下，大面積多代連續(xù)或長(zhǎng)期栽培某一作物，其抗病性仍能長(zhǎng)久保持不變，則稱(chēng)這種抗性為持久抗病性，但并不意味著永久不變【69，701。半個(gè)世紀(jì)以前育成的美國(guó)抗稈銹病的Hope，烏拉圭抗葉銹病的Americano44，巴西的Universal2和Frontana，于30年代和40年代廣泛種植，都表現(xiàn)出高水平的非小種專(zhuān)化性抗性。50年代，諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Borlaug將Hope和Frontana的抗性導(dǎo)入CIMMYT的小麥雜交育種實(shí)踐中，培育出并推廣了一系列具有持久抗性的小麥品種，從而使“綠色革命’’得以誕生并獲得成功【7l，721。4．2．2持久抗病性的遺傳在農(nóng)作物中，持久抗病性具有復(fù)雜的遺傳基礎(chǔ)。目前普遍認(rèn)為持久抗病性的遺傳學(xué)原因分為兩類(lèi)：一類(lèi)取決于抗病基因的數(shù)目，基因越多越持久，即通常說(shuō)的水平抗病性：另一類(lèi)取決于抗病基因的質(zhì)量，有些基因由于其結(jié)構(gòu)、機(jī)制復(fù)雜，病菌克服時(shí)需較大的變異，這類(lèi)基因稱(chēng)之為主效基因，少數(shù)甚至單個(gè)主效基因控制的抗病性也可能持久。有人認(rèn)為持久抗性至少是由3個(gè)基因控制的，也有人認(rèn)為由不同類(lèi)型基因控制。根據(jù)現(xiàn)有的研究和報(bào)道，持久抗病性的遺傳有單基因方式、寡基因方式、多基因方式、主效基因與微型基因共同控制等多種。4．2．2．1單基因方式單基因方式是最簡(jiǎn)單的持久抗病性遺傳方式，多為完全顯性，少數(shù)是隱性，不完全顯性的情況目前尚不能確定。在單隱性方式中，有表現(xiàn)小種專(zhuān)化性的，但抗性持久。同樣也有由單基因控制，卻不表現(xiàn)小種專(zhuān)化性，其抗性持久【731。楊華安等【74】人認(rèn)為我國(guó)小麥品種綿陽(yáng)系在條銹病重要流行區(qū)應(yīng)用，保持良好抗病性達(dá)10多年并成為當(dāng)前生產(chǎn)支柱品種，其持久抗條銹性就是由單個(gè)或少數(shù)成株抗病基因控制的。Johnson(1978)研究認(rèn)為CappelleDesprez的抗性由Yrl6控制【75】。Singh(1993)指出成株抗性基因Yrl8提供了Anza和其衍生品種(系)所具有的持14 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文久抗性。這一抗性組合(Yrl8complex)通過(guò)CIMMYT育種家的努力，現(xiàn)已廣泛地分布在其培育的小麥種質(zhì)中，在世界各小麥種植區(qū)表現(xiàn)對(duì)條銹病良好的抗病性【761。4．2．2．2寡基因方式這是由少數(shù)幾個(gè)主效基因控制的持久抗性，基因間作用比較復(fù)雜，有累加作用。Green和Campbell研究指出，加拿大小麥品種Selkrik的抗稈銹基因由St6，Sr7b、跏財(cái)、Srl7、Sr23等5個(gè)基因控制的，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其持久抗性歸因于對(duì)Sr6，毋財(cái)基因有聯(lián)合致病性的病原菌系稀少，是其抗性基因累加效應(yīng)的結(jié)果。還有非等位基因之間的互作，如對(duì)一些持久抗銹性小麥進(jìn)行遺傳分析發(fā)現(xiàn)，幾個(gè)等位基因位于不同的染色體上。至于其他基因之間的互作形式，如互補(bǔ)作用、上位性等，在持久抗病性遺傳中未見(jiàn)報(bào)道。王殿波(2004)對(duì)持久抗病性小麥品種小偃6號(hào)進(jìn)行遺傳分析結(jié)果表明，其抗病性是由一種溫度敏感型基因控制的，但不屬于溫敏微效基因。4．2．2．3主效基因和微效基因共同起作用有的持久抗病性品種是由主效基因和微效基因共同發(fā)揮作用的結(jié)果。溫敏微效基因在使抗條銹病主效基因持久性方面有其保護(hù)和協(xié)作的作用，兼有主效和微效基因的品種往往具有良好的持久抗性。如小麥持久抗條銹病品種EI．178383，除主效顯性基因外，還有三個(gè)微效隱性基因。單體分析表明，主效基因是在1B染色體上，而微效基因可能分別在5A、5B和5D上。Sharp[771認(rèn)為微效基因?qū)χ餍Щ蛴行揎椬饔谩Ｈf(wàn)安民等(2000)對(duì)在我國(guó)對(duì)條銹病保持抗性達(dá)20年之久的繁6及其衍生系研究發(fā)現(xiàn)，繁6既含有主效抗條銹基因，又含有溫敏微效基因【7引。徐世昌等(200t)通過(guò)對(duì)小麥品種京核891．1品系的研究發(fā)現(xiàn)，該品系至少含有兩對(duì)顯性主效基因和一對(duì)隱性微效抗條銹基因f791。4．2．2．4多基因方式多基因控制的持久抗病性表現(xiàn)形式多樣，往往控制病害的數(shù)量變異，如反應(yīng)型、潛育期、侵染率等，屬數(shù)量遺傳的范疇，有些類(lèi)似“水平抗性"。如燕麥抗冠銹病品種RedPustproof在很長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)，生理小種變化并未引起抗性變化，其銹病發(fā)展比感病品種晚14天，雖然后期對(duì)幾個(gè)小種感病，但無(wú)明顯的產(chǎn)量損失。Milus和Line(1986)通過(guò)對(duì)Gaines、Nugaines和Luke這三個(gè)持久抗病性品種的遺傳分析表明，這些品種對(duì)條銹病的抗性是由微效基因控制的，并且估計(jì)了各個(gè)品種的抗性基因數(shù)目、基因間互作方式、遺傳力等，并發(fā)現(xiàn)存在超親遺傳現(xiàn)象。 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文4．2．3小麥持久抗病性品種的選育和應(yīng)用Johnson等人認(rèn)為具有持久抗病性小麥品種(品系)是持久抗條銹性育種的最好親本。因此選育具有持久抗病性的小麥品種，首先需獲得具有持久抗病性的抗源材料，利用抗源材料通過(guò)各種育種途徑和方法培育具有持久抗病性的品種。實(shí)踐證明，引種是獲得具有持久抗病性的遺傳資源最簡(jiǎn)單而收效快的方法，我國(guó)自30年代先后從國(guó)外引入許多優(yōu)良抗病小麥品種作為抗源在生產(chǎn)上直接應(yīng)用。例如，南大2419、阿勃、阿夫、墨沙、洛夫林10號(hào)、山前麥等品種，這些抗性品種引入后，可直接用于生產(chǎn)種植，性狀優(yōu)良的抗性品種推廣面積已達(dá)到幾千萬(wàn)畝。但多數(shù)引入品種是作為抗源親本，通過(guò)系統(tǒng)選種和雜交育種等途徑育成新的品種后，進(jìn)行推廣種植。16 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文第二章研究的目的意義與路線(xiàn)小麥?zhǔn)鞘澜绲诙蠹Z食作物，1998年Braun認(rèn)為2020年小麥的產(chǎn)量要達(dá)到10億噸，才能滿(mǎn)足市場(chǎng)的需要，小麥的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的前提。條銹病是小麥生產(chǎn)的主要制約因素之一，200年小麥條銹病在我國(guó)大流行，受災(zāi)面積約660萬(wàn)hm2，造成小麥大面積嚴(yán)重減產(chǎn)，有些地區(qū)甚至顆粒無(wú)收，篩選和培育抗病品種是防治小麥條銹病害最為經(jīng)濟(jì)、有效和利于環(huán)境保護(hù)的途徑。采用常規(guī)育種方法培育抗病品種雖然可以有效控制該病的發(fā)生與流行，但耗時(shí)耗力，難以適應(yīng)條銹菌生理小種的變化速度。分子標(biāo)記輔助育種可有效縮短育種進(jìn)程，加快新品種的培育和利用，從而達(dá)到有效控制小麥條銹病發(fā)生的目的。近年來(lái)，分子標(biāo)記特別是微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于作物遺傳育種的各個(gè)研究領(lǐng)域。微衛(wèi)星(microsatellite)又稱(chēng)SSR(simplesequencerepeat)，分布于小麥的整個(gè)基因組中，且在小麥中能夠檢測(cè)到比較高的多態(tài)性。R6deretal(1998)構(gòu)建了包含279個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的小麥微衛(wèi)星(Simplesequencerepeats，SSR)圖譜[30l，為小麥目的基因的定位標(biāo)記提供了極大的方便。甘肅隴南是我國(guó)小麥條銹病的常發(fā)易變區(qū)和新小種的主要策源地。我國(guó)條銹菌新小種80％以上都是在這一帶首先發(fā)現(xiàn)或聚集起來(lái)的，爾后才蔓延到我國(guó)廣大麥區(qū)，是我國(guó)條銹病控制的關(guān)鍵地帶。在這一地區(qū)研究、選育和種植具有持久抗病性特點(diǎn)的小麥品種，對(duì)我國(guó)小麥條銹病的控制具有戰(zhàn)略意義。本研究以持久抗病品種里勃留拉為實(shí)驗(yàn)材料，尋找與持久抗病性緊密連鎖的分子標(biāo)記，以期為小麥持久抗條銹性分子標(biāo)記輔助選擇育種提供理論依據(jù)。具體研究技術(shù)路線(xiàn)如下：17 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文技術(shù)路線(xiàn)：18 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文第三章里勃留拉抗條銹基因的SSR標(biāo)記本研究是在對(duì)小麥品種銘賢169X里勃留拉的F2分離群體抗性鑒定的基礎(chǔ)上，建立抗感基因池，利用分子標(biāo)記SSR技術(shù)，篩選與條銹病抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)分析方法和研究結(jié)果如下。l材料與方法1．1供試材料供試材料為小麥持久抗病品種里勃留拉，感病品種銘賢169，實(shí)驗(yàn)材料由天水農(nóng)科院中梁種子站提供。2004年種植抗病品種里勃留拉，感病品種銘賢169并配制雜交組合，即銘賢169×里勃留拉，2005年得到Fl代，繼續(xù)種植Fl代種子；2006年得到由Fl代中的一株單株繁衍而來(lái)的F2群體，共126株。材料種植在自然發(fā)病條件較好的天水市農(nóng)科所中梁實(shí)驗(yàn)站，雜種后代稀植點(diǎn)播。1．2試劑與儀器1．2．1試劑1)本實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為市售。2)本實(shí)驗(yàn)化學(xué)試劑的配制參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》【82】；3)SSR引物由北京塞百盛生物工程有限公司合成；4)PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑(10×PCRBuffer、dNTP、Taq酶)均購(gòu)白天為時(shí)代蘭州百澳生物公司。1．2．2主要儀器設(shè)備1)Tgradient型PCR儀：德國(guó)WhatmanBiometra公司制造；2)5804R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司制造；3)EPS301穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：瑞典AmershamBiosciences公司制造；4)紫外凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)GEHealthCare公司制造：5)JY--CX2B序列分析電泳槽：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司制造；6)JY5000電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司制造。19 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文1．3研究方法1．3．1取樣在小麥苗期返青后取樣，于F2代各單株上部取3"---4片新鮮葉片，并單株掛牌標(biāo)記，取下的新鮮葉片裝入保鮮袋中，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，用蒸餾水沖洗葉面，濾紙吸干水分。．70"C冷凍保存，DNA提取前一天轉(zhuǎn)入．20。C冰箱。1．3．2苗期抗性鑒定田間自然發(fā)病，當(dāng)感病對(duì)照品種銘賢169的普遍率和嚴(yán)重度均達(dá)100％時(shí)，即可調(diào)查后代材料單株侵染型。調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)是傳統(tǒng)的6級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，即0型，O；型，1型，2型，3型，4型。各侵染型的描述見(jiàn)表5181,82】。根據(jù)侵染型級(jí)別及各級(jí)侵染型數(shù)目確定抗、感類(lèi)型的劃分標(biāo)準(zhǔn)。。表5．小麥條銹病苗期侵染型分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table5．TheclassificationstandardofWheatStripeRustinfectiontype1．3．3基因組DNA的提取及純度的測(cè)定1．3．3．1DNA的提取1．準(zhǔn)備工作：1)將洗干凈的研缽、研杵預(yù)先放進(jìn)冰箱冷凍室預(yù)冷，可減少液氮用量。2)田間采取的新鮮葉片放入裝有冰的冰盒中備用。3)將無(wú)水乙醇、異丙醇放入冰箱預(yù)冷。4)在CTAB抽提液(100mM"Iris．HCIpH8．0，20ramEDTA，1．4MNaCl，2％C曰圓)中加入0．巰基乙醇，使溶液終濃度達(dá)到2％(v／v)。5)將加入B．巰基乙醇的CTAB抽提液及CTAB／NaCl溶液(10％CTAB，0．7MNaCl)放在恒溫水浴鍋中65℃預(yù)熱2．提取步驟：20 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文由于SSR檢測(cè)對(duì)DNA模板的質(zhì)量要求不是很高，而且每次PCR反應(yīng)的DNA用量可少至10ng，因而可以采用Dellaportaet．a(chǎn)1．(1983)1831的高鹽CTAB提取法，簡(jiǎn)單快速，具體步驟略作修改。1)取約0．5克的新鮮葉片，葉片稱(chēng)重后剪成lem長(zhǎng)，放入預(yù)冷的研缽中加入液氮迅速研磨成為細(xì)粉狀，并快速轉(zhuǎn)移到2ml離心管中。2)在裝有葉片粉末的離心管中加入800ul預(yù)熱的CTAB抽提液，用力顛倒震蕩混勻溶液。3)將加入CTAB抽提液的離心管放入恒溫水浴鍋，65"C水浴30min，每5min顛倒混勻一次。4)加入800ul氯仿／異戊醇(24：1，v：v)，搖勻使其充分混合，冰浴靜置5min后，于4℃，75009條件下離心5min后回收上層相約400ul。5)在回收的上層相中加入40ul，65。C預(yù)熱的CTAB／NaCl溶液，顛倒混勻。6)用440ul的氯仿／異戊醇抽提，充分混勻，冰浴靜置5min后，于4。C、75009離心5min后回收上層相約300ul。7)重復(fù)步驟(6)。8)加入300ul的CTAB沉淀液(10％CTAB，50mM"Iris．HClpH8．0，10mMEDTApH8．O)，顛倒混勻。如果沉淀可見(jiàn)繼續(xù)步驟(9)，否則65"C水浴30min。9)于4"C，5009離心5min后，移出上清至另一離心管中。10)在除去上清的離心管中加入300ul的高鹽TE緩沖液(50mMTris．HCl，1MEDTApH8．0，1MNaCI)重懸沉淀。如果沉淀難于重懸，于65℃水浴30min。重復(fù)至所有的或大部分沉淀溶解。11)加入180ul異丙醇沉淀核酸，溫和混勻后于4。C，75009離心15rain。12)用300ul80％的乙醇洗滌沉淀1．-一2次，充分干燥。注意不要使沉淀滑出離心管，沉淀中既不能有殘余的乙醇，也不能過(guò)分干燥，否則難以重新溶解。13)加入50ul的TE緩沖液，于4"C下靜置，溶解沉淀，不要振蕩，高分子量DNA溶解可能需要幾個(gè)小時(shí)，溶解時(shí)間的長(zhǎng)短依DNA完整性和多糖類(lèi)污染而定。14)如果基因組DNA24小時(shí)仍不溶解，一般是由于在乙醇中時(shí)間太長(zhǎng)或者材料葉片較老，多糖含量較大，可以加入TE緩沖液后65℃水浴，待沉淀充分溶解后．20℃保存。1．3．3．2DNA純度及濃度測(cè)定為保證所提取DNA的質(zhì)量能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，必須檢測(cè)DNA的純度和濃度，檢2l 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文測(cè)方法如下：1．1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)1)1％瓊脂糖凝膠的制備：O．49瓊脂糖中加入40ml的1×TAEbuffer，微波爐加熱至融化，待冷卻至50．60"C時(shí)加入約l“l(fā)的10mg／mlEB溶液，搖勻后緩緩倒入膠槽中，使膠液形成均勻的膠層，差入梳子。待膠完全凝固后拔出梳子，然后向電泳槽內(nèi)加入1×TAEbuffer至液面恰好沒(méi)過(guò)膠面。2)點(diǎn)樣：取2plDNA樣液，加入適量的6×LoadingBuffer混勻后，加入樣品槽點(diǎn)樣孔中，電泳電壓120V，電泳至溴酚藍(lán)帶快到達(dá)膠的另一側(cè)。3)觀察，照相：取出凝膠放在紫外透射儀下，于紫外凝膠成像分析系統(tǒng)中進(jìn)行凝膠成像，觀察分析DNA的條帶。DNA條帶若呈現(xiàn)一條遷移率很小的整齊條帶，表明所提樣品較純。如果在溴酚藍(lán)前有彌散的熒光區(qū)出現(xiàn)，則表明樣品中存有RNA雜質(zhì)，若所提總DNA在瓊脂糖凝膠上不能形成清晰的條帶，而只是彌散一片，則表明DNA已嚴(yán)重降解。2．紫外吸收法測(cè)定取5ulDNA樣液，加超純水至lml，混勻，置于石英比色杯中，以超純水為空白對(duì)照，在紫外分光光度計(jì)下分別測(cè)量260nln、280nm、230nm的OD值。1)純度判定：純的DNA溶液，其OD260／OD280值應(yīng)在1．6．1．9之間，大于1．9時(shí)，表明有RNA污染，小于1．6時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染；OD260／OD230應(yīng)小于2．0時(shí)，表明溶液中有殘存的鹽或小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。2)濃度計(jì)算：DNA樣品濃度(1ag#d)=OD260XNX50／1000注：雙鏈DNAOD260=1．0時(shí)溶液濃度為50I．tg／ml，N為稀釋倍數(shù)。根據(jù)濃度分析結(jié)果，將樣品DNA濃度統(tǒng)一配制為20ng／lal的DNA樣液。1．3．4SSR擴(kuò)增穩(wěn)定性探索實(shí)驗(yàn)1．3．4．1SSR反應(yīng)體系優(yōu)化為了得到高效的擴(kuò)增產(chǎn)物，在進(jìn)行SSR擴(kuò)增前，DNA擴(kuò)增的條件首先需要優(yōu)化，最終實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增可重復(fù)的SSR圖譜。我們?cè)谇叭搜芯康幕A(chǔ)上，分別對(duì)SSR反應(yīng)體系(模板濃度、lOXTaqBuffer、Tag聚合酶濃度、dNTPs濃度、引物濃度)進(jìn)行了摸索研究：1)將模板設(shè)計(jì)成0．5I_tl、llil、1．5}tl、2．0I_tl4個(gè)不同梯度，選擇PCR反應(yīng)的最 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文佳模板的量；2)將10XTaqBuffer設(shè)計(jì)成1．0p1、1．59l、2．09l、2．59l、3．09l的5個(gè)不同梯度，選擇10XTaqBuffer最佳反應(yīng)量；3)將lmmol／L的dNTPs設(shè)計(jì)成1．09l、1．59l、2．09l、2．59l、3．09l的5個(gè)不同體積梯度，選擇反應(yīng)最佳的體積；4)將2．5U／glTaq酶設(shè)計(jì)成0．19l、0．59l、1．09l、1．5p1、2．09l的5個(gè)不同體積梯度的找出適宜的TaqDNA聚合酶體積范圍：5)將10弘mol／L的引物設(shè)計(jì)成O．1pl、0．5pl、1．0p1、1．59l、2．0p1的5個(gè)不同體積梯度，找出適宜的primer體積范圍；1．3．4．2PCR擴(kuò)增條件探索對(duì)擴(kuò)增條件逐一進(jìn)行微調(diào)，每次保持其它條件不變，只改變其中一個(gè)因素，確定最優(yōu)的反應(yīng)條件。1)將變性溫度及時(shí)間分別設(shè)計(jì)成：(D94。C，95℃；②60s、50s、10s、5s2)將退火溫度及時(shí)間分別設(shè)計(jì)成：①退火溫度依據(jù)不同引物而定②90s；50s，3)將循環(huán)次數(shù)設(shè)計(jì)成：①30次、②35次、③40次、④45次4)將延伸時(shí)間設(shè)計(jì)成：30s，lmin，2min1．3．5SSR引物的選取根據(jù)Rc；de等【30】建立的具有279個(gè)位點(diǎn)的小麥微衛(wèi)星遺傳連鎖圖上確定的微衛(wèi)星位點(diǎn)，隨機(jī)選取引物共100對(duì)，分布在小麥的3個(gè)染色體組(A、B、D)21條染色體上。1．3．6SSR引物多態(tài)性篩選用所選取的100對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)抗病親本里勃留拉和感病親本銘賢169進(jìn)行掃描，篩選出在兩親本間具有多態(tài)性的引物。1．3．7SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)1．3．7．1變性的聚丙烯胺凝膠電泳檢測(cè)．1)玻璃板的清洗：用洗滌靈把玻璃板清洗干凈后，用蒸餾水反復(fù)擦洗，將洗干凈的玻璃板用95％的乙醇均勻擦拭。干燥后，用親和硅烷試劑(49l親水硅烷(repel)，49l冰醋酸，929l雙蒸水，19009l無(wú)水乙醇)均勻擦拭平板，用剝離硅烷試劑(2％疏水硅烷(binding)，氯仿配制)均勻擦拭凹板，操作過(guò)程中，注意防止兩塊玻璃板相互污染。待玻璃板徹底干燥后，將處理好的玻璃板中間加入間隔片，用夾子均勻夾緊玻璃板邊緣。 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文2)凝膠的配置：在65ml的6％丙稀酰胺溶液中加入1201al的10％過(guò)硫酸胺，60I．tlTEMED，快速搖勻。3)灌膠：將兩玻璃板傾斜成20。角，將搖勻的膠沿灌膠口緩緩灌入，并輕輕敲打玻璃板，以防混入氣泡，當(dāng)膠灌至玻璃板上部時(shí)，在灌膠口緩緩插入鯊魚(yú)齒梳子，并注意防止梳子底部產(chǎn)生氣泡。若有少量膠漏出，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)加聚丙烯酰胺溶膠。將灌好膠的玻璃板水平放置，室溫讓其聚合lh以上。4)預(yù)電泳：將鯊魚(yú)齒梳從制好的膠中拔出，膠板安裝到電泳槽上。加入l×TBE緩沖液，恒功率70W，電泳30min左右。5)變性：取51alPCR擴(kuò)增產(chǎn)物與2ulLoadingBuffer(甲酰氨98％，pH8．0EDTA10raM，溴酚蘭0．25％，二甲苯青0．25％)均勻混合，95。C變性處理5min，取出冰上冷卻，待點(diǎn)樣。6)電泳：預(yù)熱的變性膠面，用吸管沖去點(diǎn)樣孔中的尿素，插好洗凈的鯊魚(yú)齒梳，制出點(diǎn)樣孔，取5lxl變性好的PCR產(chǎn)物上樣。恒功率70W電泳1．5．2h。1．3．7．2銀染顯色銀染方法參照Sanguinetii等【跗】的方法，部分步驟略做改進(jìn)。銀染全部過(guò)程在搖床上進(jìn)行。1)固定與脫色：將電泳后的膠放入固定液(150ml無(wú)水乙醇+10ml醋酸+1340ml蒸餾水)中，平行搖動(dòng)20"'30分鐘，直至指示劑的顏色褪去為止。固定液可多次利用。2)水洗：用蒸餾水水洗10"--15min。3)銀染：把膠放入染色液(39AgN03+1500ml蒸餾水)中，輕輕的平行搖動(dòng)20--一30min。鍆水洗：蒸餾水迅速水洗5s。5)顯影：將膠放入顯影液(22．59NaOH+1500ml蒸餾水)中輕輕平行搖動(dòng)，直至條帶出現(xiàn)，清晰為止。6)定影：用步驟(1)的固定液即可，定影約3"--5min。7)水洗：用蒸餾水水洗2"--'3min。8)觀察、統(tǒng)計(jì)：室溫干燥后，以pBR322DNA／MspIMarker進(jìn)行分子量估測(cè)，統(tǒng)計(jì)帶型并照相1．3．8抗病池和感病池的構(gòu)建根據(jù)Michelmoreeta1(1991)[851介紹的集群分析分離法，簡(jiǎn)稱(chēng)BSA(Bulk 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文SegregateAnallysis)法，從F2群體中選取10株極抗病株，將其單株DNA等量混合，構(gòu)建成抗病基因池；再取10株極感病株，將其單株DNA等量混合，建立F2群體的感病基因池。用在兩個(gè)親本間表現(xiàn)多態(tài)性的引物掃描抗池和感池，尋找在抗池和感池間多態(tài)，且在抗池和感池中均表現(xiàn)一致、沒(méi)有分離的引物，根據(jù)該引物所在的染色體位置，從而將目標(biāo)基因定位在具體的染色體上。1．3．9電泳數(shù)據(jù)的處理和遺傳距離的估算用篩選到的特異引物對(duì)F2群體進(jìn)行微衛(wèi)星擴(kuò)增及變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，將F2代群體單株基因組擴(kuò)增的帶型分為三種：抗病親本帶型、感病親本帶型及兩者的雜合帶型。表現(xiàn)型數(shù)據(jù)結(jié)合PCR擴(kuò)增帶型用于連鎖分析，用MapMaker3．0軟件以最大似然法計(jì)算標(biāo)記與抗病基因的遺傳距離。2結(jié)果分析2．1里勃留拉的抗性遺傳分析調(diào)查所得后代群體植株的反應(yīng)型如表6所示。F2群體共126株，田間鑒定23株抗，侵染型為毗，87株感，侵染型為3~4，。由于實(shí)驗(yàn)地當(dāng)年氣候嚴(yán)重干旱，使得部分幼苗出現(xiàn)干死、旱死現(xiàn)象，其中16株幼苗干死嚴(yán)重，因此無(wú)法進(jìn)行田間鑒定抗感性。對(duì)可鑒定的F2群體卡方測(cè)驗(yàn)結(jié)果(#=o．34，P值o．70-4)．50)表明：材料群體基本符合3R：13S的分離比例，由此可推出持久抗銹品種里勃留拉的抗性是由1對(duì)顯性基因和l對(duì)隱性基因互補(bǔ)控制的。表6里勃留拉與銘賢169雜交n世代的抗條銹性表現(xiàn)Table6ResistancephenotypeofF2generationderivedfromMingxianl69xLibellula2．2小麥基因組DNA的提取用Dcllaportact．a(chǎn)1．(1983)1拘方法提取小麥材料基因組DNA，成功提取小麥F2代單株DNA共122株。用紫外吸收法測(cè)定DNA樣品純度后，計(jì)算基因組DNA濃度，根據(jù)計(jì)算值將基因組DNA分別稀釋成20ng／pl，用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)稀釋 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果表明供試材料的基因組DNA主帶清晰而集中，說(shuō)明DNA提取完整、無(wú)降解現(xiàn)象，適合于SSR分析。小麥基因組部分DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1。圖1．供試小麥材料的基因組DNAFi91．GenomicDNAextractedfromwheatmaterialstested123456781-8：部分F2代群體；1-8：PartsofF2plants2．3SSR標(biāo)記分析2．3．1SSR擴(kuò)增反應(yīng)體系和程序通過(guò)一系列的試驗(yàn)，確定了適合本研究基因組DNA最佳SSR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?？偡磻?yīng)采用25ul反應(yīng)體系。1)PCR反應(yīng)體系：?jiǎn)挝?¨1)TemplatePrimer1(10uM)Primer2(10uM)10×TaqBuffer(M92+Plus)dNTPsMixture(2．5mM)Taq(2．5U／u1)ddH202)PCR反應(yīng)程序?yàn)椋篠tepl95。C，預(yù)變性4min：Step294。C，變性50s；P,魂魄Ps隧鼉魏魏浚戮魏魏豫穩(wěn)＆隗P#魏豳綴M：MakerlPR：抗病親本；Ps：感病親本M：Maker；PR：Parentofresistance；Ps：Parentofsusceptible表7．選用引物位置及擴(kuò)增出目標(biāo)條帶的有無(wú)綴PrimersAtwhichTargetPrimersAtwhichTargetPrimersAtwhichTargetChromosomebeltChromosomebeltChromosobelt————————————————————=——————————————————————————————————一一一一litl％,Xgwml36IA無(wú)Xgwm3012D無(wú)Xgwm5835D有Xgwml64IA無(wú)Xgwm2612D無(wú)Xgwm5655D無(wú)Xgwm99IA無(wú)Xgwm3202D有Xgwml925D有Xgwm273IB有Xgwm4842D有Xgwm2925D有Xgwml531B無(wú)Xgwm3492D無(wú)Xgwm4946A有Xgwmll1B有Xgwm3693A無(wú)Xgwm5706A有Xgwm2681B有Xgwm3913A無(wú)Xgwm4276A有Xgwm413IB有Xgwml553A無(wú)Xgwm3346A有27攀 ————————————————————■———————————————————————————————————————一一Xgwm498IB有Xgwm3893B無(wú)Xgwm5186B無(wú)。Xgwm403IB無(wú)Xgwm2993B無(wú)Xgwm706B無(wú)Xgwml40IB有Xgwm2853B無(wú)Xgwm6136B有Xgwml8IB有Xgwml813B無(wú)Xgwm886B無(wú)Xgwm259IB無(wú)Xgwm5663B有Xgwm6266B無(wú)Xgwm550IB有Xgwml613D無(wú)Xgwm3256D無(wú)Xgwm642ID有Xgwm6643D無(wú)Xgwm4696D無(wú)Xgwm458ID有Xgwm4563D無(wú)Xgwm607A無(wú)Xgwml06ID無(wú)Xgwm3974A無(wú)Xgwm2767A有Xgwm5122A有Xgwm6014A無(wú)Xgwm2337A無(wú)Xgwm3722A無(wú)Xgwm6374A無(wú)Xgwm2827A有Xgwm3562A無(wú)Xgwml604A無(wú)Xgwm437B有Xgwml02A無(wú)Xgwm5384B無(wú)Xgwm3447B有Xgwm3122A有Xgwm2514B有Xgwrrd337B有Xgwm2572B有Xgwm4954B無(wú)Xgwm2977B無(wú)Xgwml482B有Xgwml134B無(wú)Xgwm400713有Xgwm3882B無(wú)Xgwm64B有Xgwm5777B無(wú)Xgwm5262B無(wú)Xgwm3684B有Xgwm537713無(wú)Xgwm5012B無(wú)Xgwm6244D有Xgwm467B有Xgwm3192B有Xgwm6094D無(wú)Xgwm3027B無(wú)Xgwm4292B有Xgwml565A有Xgwm569713有Xgwm3742B有Xgwm2935A無(wú)Xgwm2957D無(wú)Xgwml202B有Xgwm4435B有Xgwmlll7D無(wú)Xgwm6302B無(wú)Xgwml595B無(wú)Xgwm4377D無(wú)Xgwm5392D有Xgwm4085B無(wú)Xgwml572D有Xgwm4995B有———————————————————————————————————————————————一一2．3．1．2SSR引物在兩池間的擴(kuò)增選取極抗和極感單株的DNA分別等量混合，構(gòu)成抗病池和感病池，采用SSR技術(shù)，對(duì)在親本間有多態(tài)性的46對(duì)引物進(jìn)行進(jìn)一步篩選，l@Xgwml8能在兩池之間擴(kuò)增出穩(wěn)定、清晰的帶紋，且與抗感親本擴(kuò)增條帶結(jié)果一致，初步表明引物Xgwml8與目標(biāo)基因連鎖。根據(jù)引物Xgwml8所在的染色體位置，初步將目標(biāo)基因定位在染色體1B上。2．3．2多態(tài)性SSR引物Xgwml8的群體檢測(cè)隨機(jī)選取小麥1B染色體組的II對(duì)微衛(wèi)星引物，其中有5對(duì)引物(序列見(jiàn)表8)在兩親本間有多態(tài)性。用這5對(duì)引物對(duì)F2群體單株進(jìn)行掃描。兩親本的特異帶分別記做A型帶(抗病親本的帶型一致)，B型帶(與感病親本一致的帶型)?？共〕?cái)U(kuò)增出與抗病親本相一致的特異帶，記做A型帶。感病池?cái)U(kuò)增出的條帶和感病親本的特異帶大小相同，記做B型帶。在F2群體中同時(shí)擴(kuò)增出兩親本不同的兩條特異帶， 記做H型帶(圖3)。表．8抗條繡病基因微衛(wèi)星標(biāo)記及其染色體定位Table．8MicrosatellitelociandtheIocationonchromosome微衛(wèi)星染色體位置引物序列退火溫度(℃)Xgwml81BXgwm498Xgwml40TGGCGCCATGArTGCATTATClvr℃GGTTGCTGAAGAACC11AmAGG1BAGGGGATATGTTGTCACTCCA11．ATGTGATTGCG1ACGTACCC1BGGTGGTATGGACTⅪGGACACT11TGCATGGAGGCAC√蛆’ACT1BATGGAGArAllTGGCCllACAACCTTGACrrCAAGGCGTGACA5558lBCCCACAAGAACCllTGAAGAXgwm55061CATTGTGTGTGCAAGGCAC圖3引物Xgwml8在擴(kuò)增F2單株的PCR產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果Fi93·ElectrophoresisofPCRproductamplifiedwithSSRmakerXgwml8inpolyacrylamidegel．M-Maker；PR：抗病親本；Ps：感病親本；BR：抗病池；Bs：感病池；l~23：部分砣代單株；M：Maker；Pa：Parentofresistance；Ps：Parentofsusceptible；BR：Theresistancepool；Bs：Thesusceptiblepool；l～23：TheF2plants．提取F2單株DNA，共得到124株DNA。進(jìn)行擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)結(jié)果如表9所示。用抗、感池篩選獲得的與目標(biāo)基因連鎖的引物Xgwml8和1B染色體上在親本間多 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文態(tài)性SSRXgwm268、Xgwm498、Xgwml40和Xgwm550掃描F2群體，所有引物在F2群體中的分離比例都符合期望比例1：2：1，卡平方測(cè)驗(yàn)的P值>0．05。表9．Fz群體單株P(guān)CR結(jié)果帶型統(tǒng)計(jì)Table9．ThenumberofbeltafterPCRamplieationinF2progenies2．3．3引物Xgwml8與抗病基因的連鎖圖圖4．小麥1B染色體上里勃留拉抗條銹病基因的微衛(wèi)星圖譜Fi94．Microsatellitemapofchromosome1BcarryingLibellulaStripeRustResistantGene3討論3．1關(guān)于親本的選配在進(jìn)行遺傳分析時(shí)，親本的選配對(duì)分析結(jié)果影響很大，要分析抗源材料或某些品種的抗性遺傳特點(diǎn)，一般選用的感病親本要不含任何抗病基因，才可保證對(duì)供試材料分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，親本選配的原則也有所不J382孔住帆瓴 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文同。本研究所選用的親本為里勃留拉、銘賢169，其中里勃留拉為持久抗銹品種，是20世紀(jì)70年代初從意大利引進(jìn)我國(guó)的，在甘肅隴南小麥條銹病常發(fā)易變區(qū)種植歷史已達(dá)30多年，播種面積始終在3000hm2以上，面積種植最大的年份達(dá)到34000姘，且在銹菌越冬區(qū)及越夏區(qū)均有大面積栽培，雖然該品種歷經(jīng)了30年10多個(gè)條銹菌生理小種的考驗(yàn)，但是抗病性依然十分穩(wěn)定，至今仍是生產(chǎn)上主體品種。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)F2群體的田間鑒定結(jié)果表明，F(xiàn)2群體符合3抗：13感的分離比例，即符合由l對(duì)顯性基因和l對(duì)隱性基因互補(bǔ)控制的規(guī)律。3．2關(guān)于里勃留拉的持久抗病性R．Johnson提出品種大面積種植并在長(zhǎng)期內(nèi)保持抗病性是確認(rèn)持久抗性的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)[86,87]這是因?yàn)槠贩N在大面積種植后增強(qiáng)了條銹菌定向選擇的壓力，只有在這種情況下依據(jù)相應(yīng)的致病小種能否得以形成和品種抗性會(huì)不會(huì)喪失，才能對(duì)品種的持久抗性作出根本的判斷。里勃留拉在隴南種植約30年，且銹菌越夏區(qū)和越冬區(qū)均有大面積栽培，經(jīng)歷了十多個(gè)銹菌小種的考驗(yàn)，卻始終保持穩(wěn)定的抗銹性，可確認(rèn)為持久抗性品種。根據(jù)抗病性劃分為垂直抗性和水平抗性的觀點(diǎn)，由主效基因控制的品種在育成之初表現(xiàn)突出的抗性，但新小種產(chǎn)生后易于嚴(yán)重喪失抗性，因此抗性保持時(shí)間短；而有多個(gè)微效抗病基因控制的品種，能感染多個(gè)小種，但發(fā)病輕，產(chǎn)量穩(wěn)定，抗性也可相對(duì)持久【88】。根據(jù)里勃留拉多年來(lái)田間種植情況表明，里勃留拉符合水平抗性品種所具有的表現(xiàn)特點(diǎn)。3．3關(guān)于條銹病抗感性的劃分記載侵染型是應(yīng)根據(jù)具體情況做到盡可能詳細(xì)，分級(jí)宜細(xì)不宜粗，使侵染型變化盡可能反映出基因型的差異，必要時(shí)，在相同侵染型中還應(yīng)用嚴(yán)重度加以進(jìn)一步細(xì)分，以便在分析時(shí)進(jìn)行處理分類(lèi)。在抗條銹基因遺傳分析時(shí)，最好采用O，0；，O：+，l，1+，2，2+，3一，3，3+，4共11級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，而在常規(guī)的抗性鑒定中采用0，O；，l，2，3，4共6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)即可。本試驗(yàn)采用0，0：，1，2，3，4共6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)銘賢169X里勃留拉的F2群體進(jìn)行田間鑒定標(biāo)準(zhǔn)。即0，0；，1，2為抗病型，3，4為感病型，由于鑒定標(biāo)準(zhǔn)的判斷存在著很大的人為性，因此其鑒定難度較大，鑒定結(jié)果存在一定誤差。3．4PCR反應(yīng)體系各組分的影響SSR標(biāo)記包括兩個(gè)步驟：PCR反應(yīng)和電泳檢測(cè)。針對(duì)不同作物建立相適應(yīng)的PCR 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文反應(yīng)體系，是取得試驗(yàn)成功的關(guān)鍵【8川。影響SSR-PCR穩(wěn)定性的因素有內(nèi)部和外部因素。內(nèi)部因素即PCR反應(yīng)體系中的各組分的影響，其中包括模板DNA的純度和濃度、引物的質(zhì)量和特異性、Taq聚合酶的用量、MgCl2、dNTP的濃度。外部因素主要包括PCR儀的型號(hào)、PCR反應(yīng)程序的設(shè)定、電泳條件等。為了得到高效的擴(kuò)增產(chǎn)物，在進(jìn)行SSR擴(kuò)增前，DNA擴(kuò)增的條件首先需要優(yōu)化，最終實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增可重復(fù)的SSR圖譜嗍。在本試驗(yàn)中，我們?cè)谇叭搜芯康幕A(chǔ)上，分別對(duì)SSR反應(yīng)體系(模板濃度、10xbuffer、Tag聚合酶濃度、dNTP濃度、引物濃度)進(jìn)行了摸索研究，得到一套適合本實(shí)驗(yàn)要求的SSR反應(yīng)條件：10xbuffer2．59l、Tag聚合酶(2．5U／laD0．59l、dNTP(2．5mM)2pl、引物(10uM)各O．59l。其中發(fā)現(xiàn)，模板DNA的量在50．200ng之間都能擴(kuò)增出適于分析的有效條帶，說(shuō)明基因組模板濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果并沒(méi)有明顯影響，這表明SSR技術(shù)對(duì)DNA質(zhì)量要求不高。3．5關(guān)于BSA法BSA(集團(tuán)分離分析法，又稱(chēng)分離體分組混合分析法或混合分組分析法，BulkSegregateAnallysis)分析法首次由Michelmore等【85】提出并成功地在萵苣中篩選出與目的基因相連鎖的標(biāo)記。該方法首先從一對(duì)具有目標(biāo)基因的表型差異的親本所產(chǎn)生的任何一種分離群體中，根據(jù)目標(biāo)基因的表型分別選取一定數(shù)量的植株，構(gòu)成2個(gè)亞群或集團(tuán)。將每群的DNA等量混合，形成兩個(gè)相對(duì)性狀的“基因池”(genep001)，然后用合適的分子標(biāo)記對(duì)兩個(gè)基因池進(jìn)行分析，在兩群間表現(xiàn)多態(tài)性的分子標(biāo)記遺傳上與目標(biāo)性狀基因座位相連鎖。在獲得了與目標(biāo)基因相連鎖的分子標(biāo)記以后，可以利用某一作圖群體進(jìn)行分析以便進(jìn)一步檢測(cè)所得分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀基因的連鎖程度，以及其在某已知分子圖譜中或染色體上的位置，這樣才能完成真正意義上的對(duì)基因的標(biāo)記定位。由于建池時(shí)使用了特定的分離群體，并且在分組時(shí)僅對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，這樣可以保證其他性狀的遺傳背景基本相同，兩個(gè)基因池之間理論上就應(yīng)主要在目標(biāo)基因區(qū)段存在差異，因此兩基因池又被稱(chēng)為近等基因池，這就排除了環(huán)境及人為因素的影響，使研究結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠【91】。在實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用BSA法需要注意以下一些問(wèn)題：1)在親本的選擇上要有科學(xué)的性狀選擇標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)親本進(jìn)行性狀鑒定，利用兩親本雜交后分離的F2代構(gòu)建基因池。本實(shí)驗(yàn)中選擇的兩親本(里撥留拉，名賢169)分別為抗病和感病品種，在目標(biāo)性狀上存在較大差異，可用于BSA法進(jìn)行分子標(biāo)記定位。實(shí)驗(yàn)材料由銘賢169X里勃留拉雜交的Fl代中的一株單株繁衍而來(lái)的32 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文F2群體。2)兩池內(nèi)各株的DNA要等量混合，兩親本的遺傳背景比較一致時(shí)，建池植株數(shù)可少至5株，如遺傳背景差距較大，可增加株數(shù)。在本實(shí)驗(yàn)中，利用紫外吸收法計(jì)算基因組DNA濃度，根據(jù)計(jì)算值將基因組DNA分別稀釋成等濃度，從而保證兩池內(nèi)的各株DNA能夠等量混合。建池前用初步篩選的46對(duì)引物分別和F2群體單株進(jìn)行擴(kuò)增，目的為剔除雜和體，從而保證抗感池的表現(xiàn)與親本相同。由于小麥基因組太大，建池的株數(shù)不宜太大，否則多態(tài)性太高。3．6引物與抗病基因之間的關(guān)系本研究將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總，利用Mapmaker3．0構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，結(jié)果Xgwm引物的排序和長(zhǎng)短臂位置與R6deretal(1998)發(fā)表的順序相悖，鑒于此，利用GGT軟件(VanBerloo1999)構(gòu)建了1B染色體上兩親本間多態(tài)的SSR標(biāo)記圖譜，并根據(jù)BSA分析結(jié)果將抗銹基因(Yr-Liu)標(biāo)記在Xgwml8附近，而沒(méi)有進(jìn)一步標(biāo)記該基因在1B上的具體位置。出現(xiàn)這一問(wèn)題的原因可能在于F2單株的大量死亡，由于2007年天水遭遇旱災(zāi)，試驗(yàn)點(diǎn)(天水農(nóng)科所中梁試驗(yàn)站)缺乏灌溉實(shí)施，造成F2單株大量死亡，這樣就破壞了F2群體的天然分離比例。因此，關(guān)于持久抗條銹品種里撥留拉所攜帶的抗銹基因的準(zhǔn)確位置有待進(jìn)一步研究。 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文致謝本研究是在導(dǎo)師尚勛武教授和王化俊教授的悉心指導(dǎo)下完成的，從論文的選題、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到材料的創(chuàng)建、收集、實(shí)施、結(jié)果分析，直到論文的最后完成無(wú)不凝結(jié)著兩位老師的心血。千言萬(wàn)語(yǔ)無(wú)法表達(dá)我的感激之情!三年來(lái)，兩位導(dǎo)師不但在課題研究上傾注了大量心血，而且在我的個(gè)人成長(zhǎng)過(guò)程中給予了極大關(guān)心、支持和鼓勵(lì)。三年中從導(dǎo)師處學(xué)到的不僅僅包括前沿的學(xué)術(shù)思想和實(shí)驗(yàn)技能，而且還有做人的道理。恩師嚴(yán)謹(jǐn)務(wù)實(shí)的工作態(tài)度、謙虛謹(jǐn)慎的學(xué)術(shù)風(fēng)格和高瞻遠(yuǎn)矚的大家風(fēng)范如同指路的明燈，將永遠(yuǎn)照亮弟子的前進(jìn)方向。在此特向尚勛武教授和王化俊教授致以誠(chéng)摯的謝意!在論文的完成過(guò)程中，得到了甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室全體老師和同學(xué)的大力幫助，正是各位老師和同學(xué)的關(guān)心和支持，我的實(shí)驗(yàn)才得以完成。感謝在天水農(nóng)科所中梁試驗(yàn)站做大田鑒定期間，中梁試驗(yàn)站站長(zhǎng)宋建榮研究員、岳維云老師和呂莉莉、王希恩、張耀輝、王娜、宋怡等小麥組成員的幫助。感謝王漢寧老師、黨占海老師的評(píng)閱并提出了寶貴的意見(jiàn)和建議。試驗(yàn)過(guò)程中還得到戎偉碩士、邊秀秀碩士、周喜旺碩士，馬占軍碩士，師弟車(chē)卓和師妹任亮的幫助。余斌同學(xué)在試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)過(guò)程中提出了寶貴意見(jiàn)和支持，在此一并感謝!感謝我的舍友們?nèi)陙?lái)在生活和學(xué)習(xí)上給我的幫助和關(guān)心。本文的完成還離不開(kāi)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院老師的辛勤培育。感謝他們?cè)谶@三年的時(shí)間里對(duì)我們的關(guān)懷。最后，我要在這里感謝對(duì)我的學(xué)習(xí)和研究工作給予巨大支持的父母，幾十年來(lái)他們起早貪黑，辛勤勞作，無(wú)怨無(wú)誨，為子女的教育付出了自己的一切。在此，謹(jǐn)向所有在我攻讀碩士學(xué)位期間給予無(wú)私幫助的人們表示我最誠(chéng)摯的謝意!劉娟2008年5月 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文參考文獻(xiàn)【1】McintoshRA，WeUingsCR．Wheatstriperust：Globalperspectives【A】．BreedingWheatwithStripeRustResistanceconferenceproceedings．2002．CIMMYT．【2】MeintoshRA，BatianaHS，WellingsCR．Breedingforstriperustresistancetoleafrustandstriperustnwheat忉．PlantPath01．2002，41：523-一527．【3】李振岐，曾士邁．中國(guó)小麥銹病【M】．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社．2002．【4】萬(wàn)安民，吳立人，金社林，姚革，王保通．中國(guó)小麥條銹菌條中32號(hào)的命名及其特性[J】．植物病理學(xué)報(bào)．2003，30：347～352．【5】萬(wàn)安民，吳立人，金社林等．2000-2001年我國(guó)小麥條病發(fā)生和生理小種監(jiān)測(cè)結(jié)果fJ】．植物保護(hù)．2002，28(3)：5～9．【6】馬漸新，周榮華，董玉琛等小麥抗條銹病基因定位及分子標(biāo)記研究進(jìn)展【J】．生物技術(shù)通報(bào)．1999，l：1～6．【7】BiffenRH．Mendel’slawofinheritanceandwheatbreeding[J]．J．Agric．Sci．1905，1：4"-一48．【8】何家泌．，J、麥抗病遺傳學(xué)【M】．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社．1994．【9】BrowderLEParasite，host，environmentspecificityincerealrusts[J]．AnnRevPhytopath．1985，23：201～-222．【lO】周兗晨，張相歧，王獻(xiàn)平等．濱麥抗條銹基因的染色體定位和分子標(biāo)記【J】．遺傳學(xué)報(bào)．2001，28(9)：864---869．【11】LoegedngWQ，eta1．CanadianJournalofBotany[M】，1971．【12】Mago，SpielmeyerW，LawrenceGJ，LagudahES，EllisJGAPryor．IdentificationandmappingofmolecularmarkerslinkedtorustresistancegeneslocatedOllchromosome1RSofryeusingwheat-ryetranslocationlines[J]．TheorApplGenet．2002，104：1317"--1324．【13】郭愛(ài)國(guó)．小麥抗病性基因推導(dǎo)方法的發(fā)展及利用【J】．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)．1993，16(2)：98～103．【14】朱桂清．小麥抗稈銹病基因推導(dǎo)的計(jì)算機(jī)應(yīng)用程序及應(yīng)用【J】．沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)．1998，1290)：205"--209．【15】方宣鈞，吳為人，唐紀(jì)良．作物DNA標(biāo)記輔助育種【M】．北京：科學(xué)出版社．2001．【16】鄭敏，羅玉萍．真核生物基因組多態(tài)性分析的DNA指紋技術(shù)【J】．生物技術(shù)．1999，9(3)：35"38．【17】陳萬(wàn)民，馮潔．DNA分子標(biāo)記在植物真菌病害研究中的應(yīng)用【J】。植物保護(hù)學(xué)報(bào)。1999，26(3)：277"--282．[18】AutriqueJE，eta1．RFLPmappingofgenesassociatedwithdifferentagronomictraitsand35 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文IIdiseaseresistenceinwheat[J]．AbstractofIntemationPlantGenomeIII．1995，p8，SanDiego，USA．[19】SunGL，F(xiàn)ahimaT，KorolAB，eta1．IdentificationofmolecularmarkerslinkedtotheYrl5StriperustresistancegeneofwheatorignatedinwildemmerwheatTriticumdicoccoides[J]．Theor．Appl．Genet．1997，95：622～628．【20】PengJH，eta1．Microsatellietaggingofthestripe-rustresistancegeneYrH52derivedfromwildemmerwheat，triticumdicoccoides，andsuggestivenegativecrossoverinterferenceonchromosome1a[J]．TheorApplGenet．1999，98：862"--872．[21】WilliamsJCK，KubelikAR，LivakKJctal，NucleicAcidsResearch叨，1990，18：6531"。6535．【22】WelshJ，McclellandMO．FingerPrintinggenomesusingPCRwitharbitraryPrimers【J】．NucleicAcidsResearch．1990，18：7213～7218．【23】OlivierR，ChristineA，F(xiàn)rancoiseD．IdentificationofmolecularmarkersforthedetectionoftheyellowrustresistancegeneYrl7inwheat[J]．MolecularBreeding．1999，5(2)：167～175．【24】牛永春，劉紅彥小麥品種“l(fā)ee”抗條銹基因的RAPD標(biāo)記【J】．高科技通訊．1998，12：11～14．[25】SunGL，F(xiàn)ahimaT，KorolAB，eta1．IdentificationofmolecularlingkedtotheYrl5StriperustresistancegeneofwheatoriginatedinwildemmerwheatTriticumdicoccoides[J]．TheorApplGenet．1997，95：622～628．【26】ChagueV，F(xiàn)ahimaF，DahanA，SunOL，KomlAB，RoninYL，GramaA，RodeMSr，NevoE．IsolationofmicrosatelleteandRAPDmarkersflankingtheYrl5geneofwheatusingNILsandbulkedsegregantanalysis[J]。Genome．1998，42：1050--"1056．[27】LittM，JALuty．Ahypervariablemicrosatelliterevealedbyinvitroamplificationofadinucleotiderepeatwithinthecardiacmuscleactingene[J]．Am．J．Hum．Genet．1989，44：397"-401．【28】WangZ，JLWeber，QZhong，eta1．SurveyofplantshorttandemDNArepeats[J】．Theor．Appl．Genet．1994，88：l"---6．【29】張學(xué)勇。李大勇．小麥及其近親基因組中的DNA重復(fù)序列研究進(jìn)展【J】．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)．2000，33(5)：14～2．【30】ROderMS，KoeztmVWendehakeKeta1．Amicrosatellitemapofwheat[J]．Genetics，1998，149：2007～2023．【31】PengJH，eta1．High—demitymolecularmapofchromosomeregionharboringstripe—rustresistencegenesYrH52andYrl5derivedfromwildminerwheat，Triticumdicoccoides[J]．Genetica．2000，109(3)：199～210．【32】BomerA，Roderm．S，UngerO，eta．1Thedetectionandmolecularmappingofamajorgene36 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文一l————II——II．II--詈詈皇fomon-specificadult-plantdiseaseresistanceagainststriperust(Pucciniastdiofrmis)inwheat[J]．TheoreticalandAppliedGenetics．2000，100(7)：1095"--1099．【33]PlaschkeJ，GanalMW，RoderMS．SSRdetectionofgeneticdiversityincloselyrelatedbreadwheatusingmicrosatellitemarkers[J]．TheorApplGenet．1995，38：715"--'723．【34】Ma．Jianxin，ZhouRonghua，DongYusheneta1．(2001)MolecularmappinganddetectionoftheyellowrustresistencegeneYr26inwheattransferredfromTriticumturgidumL．usingmicreosatellitemarkers【J】．Euphytica．2001，120(2)：219～226．【35】林鳳，徐世昌，張立軍，等．／J、麥抗條銹基因Yr2的SSR標(biāo)記【J】．麥類(lèi)作物學(xué)報(bào)．2005，25(1)：17～19．[36】黃烈健，向道權(quán)。玉米Ht近等基因系的RAPD、SSR分子標(biāo)記比較研究【J】．玉米科學(xué)．2003，11(3)：31～33．【37】方宣鈞，吳為人，唐紀(jì)良．作物DNA標(biāo)記輔助育種[M】．北京：科學(xué)出版社．2001：7～21．【38】鄭敏，羅玉萍．真核生物基因組多態(tài)性分析的DNA指紋技術(shù)【J】．生物技術(shù)．1999，9(3)：35～38．[39】郭瑞星，劉小紅，榮廷昭，等．植物SSR標(biāo)記的發(fā)展及其在遺傳育種中的應(yīng)用【J】．玉米科學(xué)．2005，13(2)：8～11．【40】Zabeau，VOSESelectiverestrictionfragmentamplification：ageneralmethodforDNAfinger-pfiming【P】．EuropeanPatentApplication．1993．【41】VosP，HogersR，BleckerM，etc．AFLP：AnewtechniqueforDNAfingerpriming【J】．NucleicAcidsResearch．1995，23：4407---一4414．[42】PengJH，F(xiàn)ahimaT，RoderMSHuangQY，DahanA，LiYC。(2000)High-densitymolecularmapofchromosomeregionharboringstripe—rustresistencegenesYrH52andYrl5derivedfromwildmmerwheat．Triticumdicoccoides[J]．Genetica．2000，109(3)：199～210．【43】SmithPH，KorbnerR，eta1．Theisolationofyellowrustresistancegenesfromwheat[J]．Proeofthe10thcerealRustsandPowderyMildewsconference．2000，35：1～4，91～93．[44】邵映田，朱立煌．／J、麥抗銹病基因YrlO的AFLP標(biāo)記【J】．科學(xué)通報(bào)．2001，46(8)：669-～672．【45】DengZY，ZhangXQ，WangXP，eta1．IdentificationandmolecularmappingofastriperustresistancegenefromacommonwheatlineQzlB0[J]．ActaBotanicaSinica．2004，46(2)：236"--241．[46】陳新民，何中虎，史建榮等．利用SSR標(biāo)記進(jìn)行優(yōu)質(zhì)冬小麥品種(系)的遺傳多樣性研究【J】．作物學(xué)報(bào)．2003，29(1)：13-一19．【47】耿惠敏，劉紅彥，宋玉立等。40個(gè)河南省審定小麥品種遺傳多樣性的SSR標(biāo)記分析【J】。西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)．2005，14(2)：27--一32．【48】郭小麗，劉冬成，羅錚等．我國(guó)部分優(yōu)質(zhì)小麥品種遺傳差異的SSR標(biāo)記分析【J】．麥類(lèi)作物學(xué)37 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文報(bào)．2004，24(1)：1～5．【49】徐如宏，張志清，鄭有良，魏育明等．四川主栽小麥品種遺傳多樣性的SSR標(biāo)記研究【J】．麥類(lèi)作物學(xué)報(bào)．2002，22(2)：5～9．【50】RibautJM，HoisingtonD．Marker-assistedselection：newtoolsandstrategies[J]．TrendsinPlantSci．1998，3：236---239．【51】劉志勇，王曉玲．，J、麥抗葉銹基因Lr9、Lr24的分子標(biāo)記輔助選擇研究【J】．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)．2000，8(1)：13"-16．【52】TalbertLE，BrucknerPL，SmithLY．DevelopmentofPCRmarkerslinkedtoresistancetowheatstreakmosaicVirusinwheat[J]．Theor．ApplGenet．1996，93(3)：463"--467．【53】毛龍，胡含．應(yīng)用RAPD分析1個(gè)抗條銹病的小麥一黑麥易位系【J】?？茖W(xué)通報(bào)．1994，39(22)：2088～2090．【54】RobertOF，DedryverM．LeconteB，Rollandeta1．CombinationofresistancetestsandmolecularteststopostulatetheyellowrustresistancegeneYrl7inbreadwheatPlantMicrob[J]．Interac．2000，13：334～341．【55】VanderplankJE．PlantDisease：Epidemicsandcontrol【M】．AcademicPressNewYorkandLondon．1963，349．【56】VanderPlankJE．Diseaseresistanceinplant【M】．AcademicPressNewYork，1968．【57】VanderPlankJE．Host-pathogeninteractionsinplantdisease【M】．Academicpress．1982．【58】姚占軍，徐世昌，吳立人．小麥抗病性遺傳的研究進(jìn)展【J】．遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)．2002，2(6)：30---33[59】VanderplankJE．PlantDisease：Epidemicsandcontrol[M]。AcademicPressNewYorkandLondon．1963【60】曾士邁，王沛有，武修英等．，J、麥對(duì)條銹病的水平抗病性研究初報(bào)【J】．植物保護(hù)學(xué)報(bào)．1979，6(1)：1～9．【6l】全國(guó)小麥條銹病水平抗性聯(lián)合鑒定協(xié)作組小麥條銹病水平抗性多點(diǎn)聯(lián)合鑒定方法的研究初報(bào)[J】．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)．1983，16(4)：58"-'67．【62】萬(wàn)安民，牛永春，吳立人．中國(guó)小麥品種抗條銹性喪失及其治理對(duì)策【A】．植物保護(hù)與植物營(yíng)養(yǎng)研究進(jìn)展it]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999．70～75．【63】JohnsonR．Geneticbackgroundofdurableresistanc【A】．In：LambertiF，WallerJM，VanderGraaffNA．eds．DurableResistanceinCrops[C]．NewYork：PlenumPress．1983．5"-'26．【64】JohnsonR．Durableresistancedefinationofgeneticcontrolandattainmentinplantbreeding川．Phytopathology．1981，71：567～568．【65】萬(wàn)安民，吳立人，牛永春，等．持久抗小麥條銹病品種對(duì)我國(guó)主要流行小種成株抗性表現(xiàn)【A】．中國(guó)青年農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)術(shù)年報(bào)【C】．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社．1999，480～485．38 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文【66】曾士邁．作物品種抗病性持久化的研究【J】．世界農(nóng)業(yè)．1985，6(7)：29"31．【67】Vanderplank，JE著．植物病理過(guò)程的遺傳學(xué)和分子基石lti[M]．曾士邁，等譯．上?？萍汲霭妫?982．【68】Johnson，R．Theconceptofdurableresistance[J]．Phytopath．1979，69：198---199【69】彭紹裘，劉二明．作物持久抗病性的研究進(jìn)展與戰(zhàn)略【J】-湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)．1993，6(1)：14"16．【70】楊作民，曾士邁等譯．抗病性的持久性【M】．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社．1997．【71】THJacobs等著．抗病性的持久性[M】．楊作民，等譯．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社．1997．【72】何中虎，等．國(guó)際玉米小麥改良中-心(CIMMYT)NvJ"普通小麥抗病性的培育方法【M】．北京農(nóng)業(yè)科學(xué)．1993，1(4)：1～6．【73】彭紹裘，李?lèi)?ài)貞．論作物的持久抗病性【J】．湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)。1996，6(4)：27---28。[74】楊華安，吳立人，RWStubbs．綿陽(yáng)系統(tǒng)小麥品種抗條銹性分析[J】．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)．1990，20(3)：213"--'217．【75】JohnsonR．Durableresistancetoyellow(stripe)rustinwheatanditsimplicationinplantbreedinging；Inbreedingstrategiesforresistencetotherustsofwheat[J]．N．W．SimmondsandTechnicalEditors．1990，63"-75．，【76】SinghRP，SRajaramInZSLi，ZYXined．EighthInternationalWheatGeneticsSymposium[M]，V01．2．Beijing：ChinaAgriculturalScientechPress．1993，901"-905．【77】LewellenRT，SharpEL．IheritanceofminorreactiongenecombinationinwheattopucciniaStriiformisattwotemperatureprofiles[J]．Can．Jour．ofBot．1968，46：21～'26．【78】萬(wàn)安民，牛永春，徐世昌等．持久抗條銹病小麥品種抗性特點(diǎn)及其在我國(guó)的利用價(jià)值陰．作物學(xué)報(bào)．2000，26(6)：6--一9．【79】徐世昌，張敬原，趙文生等小麥京核891-1抗條銹病主效、微效基因的遺傳分析明．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)．2001，34(3)：272～'276【80】J薩姆布魯克，Dw拉塞爾．分子克隆實(shí)驗(yàn)指南【M】．黃培堂等譯．北京：科學(xué)出版社．2002．【81】盛寶欽．用反應(yīng)型記載小麥苗期白粉病【J】．植物保護(hù)．1988，1：49．【82】盛寶欽，周易林，王劍雄等．河北省和北京地區(qū)小麥白粉病菌寄主范圍研【J】．華北農(nóng)學(xué)報(bào)．1994，9(1)：101"107．【83】DellaportaSL，WoodJ，HicksJB．AplantDNAminipreparation：versionII．Plant[J]．MolBi01．1983，Rep1：19～21．【84】SanguinetiiCJ，DIASNETOE，SIMPSONAJ．RapidsilverstainingandrecoveryofPCRproductsseparatedonpolyaerylamidegels[J]．Biotechniques．1994，17(5)：914"921．【85】MichelmoreRW，ParanI，KesseliRVIdentificationofmarkerslinkedtodiseaseresistancegenesbybulkedsegregantanalysis：arapidmethodtodetectmarkersinspecificgenomicregionsusingsegregationpopulations[J]．ProcNatlAcadSciUSA．1991，88：9828--一9832．39