apobec3g轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究

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1、博士學(xué)位論文APOBEC3G轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究博士研究生：李暉指導(dǎo)老師：侯金林(教授)摘要研究背景載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽3G(APOBEC3G)是最近發(fā)現(xiàn)的胞嘧啶脫氨酶家族成員，由384個氨基酸組成，分子量為46kD，共含有兩個胞嘧啶脫氨酶結(jié)構(gòu)域，可以催化單鏈DNA胞嘧啶脫氨基生成尿嘧啶。APOBEC3G是重要的天然免疫因子，參與機(jī)體的抗病毒防御，APOBEC3G在病毒包裝過程中以出芽的方式包裝入病毒顆粒，隨感染病毒顆粒進(jìn)入新感染細(xì)胞發(fā)揮作用。APOBEC3G通過催化HIV和HBV等逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組發(fā)生dC脫氨基生成dU或直接抑制病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性而發(fā)揮抗病毒作用。APOBEC

2、3G可以在肺臟、肝臟、脾臟、睪丸、卵巢等組織以及外周血粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中廣泛表達(dá)，但是對于A3G轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)的研究甚少，目前的研究主要集中在肝細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控。研究表明佛波酯可以通過PKCct／DI／MEK／ER途徑誘導(dǎo)AOPBEC3G的表達(dá)；IFNa則可以通過不依賴STATl途徑誘導(dǎo)AOPBEC3G的表達(dá)；IFN7、IL2、ILl5和IL7等多種細(xì)胞因子亦可誘導(dǎo)A3G轉(zhuǎn)錄。HCV病毒也可以影響APOBEC3G的表達(dá)，其NS5A蛋白可以激活A(yù)POBEC3G的轉(zhuǎn)錄從而上調(diào)APOBEC3G蛋白表達(dá)。核轉(zhuǎn)錄因子Spl和Sp3可以與APOBEC3G啟動子區(qū)域的GC—box結(jié)合，參與

3、APOBEC3G基本轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。但是對于其他核轉(zhuǎn)錄因子對APOBEC3G轉(zhuǎn)錄的調(diào)控以及HBV能否影響AOPBEC3G的轉(zhuǎn)錄則未見報(bào)道。研究目的：l、研究上游激活轉(zhuǎn)錄因子1(upstreamstimulatorytranseriptionfactorl，USFl)基因?qū)POBEC3G的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。中文摘要2、研究HBV對APOBEC3G轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。研究方法：1、通過在線軟件對AOPBEC3G啟動子全長分析，尋找潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。2、pcDNA3．1(+)一USFl載體構(gòu)建：抽提HepG2細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成eDNA，PCR擴(kuò)增USFl基因后連接到pMDl8．T載體，以M

4、13F和M13R為引物PCR鑒定有目的片段插入證明pMD-USFl載體構(gòu)建成功，測序并與UCSC數(shù)據(jù)庫序列比對正確無誤后抽提質(zhì)粒，用BamHI和XhoI雙酶切連接到真核表達(dá)載體pcDNA3，1(+)上構(gòu)建peDNA_3．1(+)一USFl重組體，大量抽提質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞48小時后提取細(xì)胞總蛋白通過westernblot鑒定其表達(dá)情況。3、過表達(dá)USFl基因?qū)3G的影響：分別以peDNA3．1(+)和peDNA3。1(+)一UFl質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時抽提細(xì)胞總RNA，用Real—timeRT-PCR檢測APOBEC3GmRNA的變化；分別以peDNA3．1(

5、+)和pcDNA3，l(+)一SUFl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，加入G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，抽提細(xì)胞總RNA，用Real—time五界PCR檢測APOBEC3GmRNA的變化。4、降低USFl基因表達(dá)對APOBEC3G的影響：合成USFl小干擾RNA片段瞬時轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時提取細(xì)胞總蛋白通過westernblot檢測對USFl基因的干擾效果。提取細(xì)胞總RNA，用Real．timeRT-PCR檢測APOBEC3GmRNA的變化。5、利用雙報(bào)告基因系統(tǒng)檢測USFl基因?qū)POBEC3G啟動子的影響：pcDNA3．I(+)和peDNA3．I(+)一UFI質(zhì)粒分別與pGL3-

6、A3G載體共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染過程中為平衡轉(zhuǎn)染效率，加入phRL．SV40質(zhì)粒作為內(nèi)參同時為了保證轉(zhuǎn)染的DNA分子數(shù)和質(zhì)量數(shù)一致，加用魚精DNA補(bǔ)足質(zhì)量。轉(zhuǎn)染后48小時裂解細(xì)胞檢測雙螢光素酶的活性，觀察在不同細(xì)胞中USFl基因?qū)POBEC3G啟動子的影響，保持轉(zhuǎn)染DNA總量以及pGL．A3G的量不變的情況下，采用不同劑量的pcDNA3．1(+)一USFl質(zhì)粒與pGL．A3G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，觀察USFl基因?qū)POBEC3G啟動子影響的劑量效應(yīng)。II博士學(xué)位論文6、確定USFl基因在APOBEC3G啟動子上的作用位點(diǎn)：對APOBEC3G啟動子全長進(jìn)行分析

7、，根據(jù)APOBEC3G啟動子上E．box序列所在位置，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增一系列5’截短的APOBEC3G啟動子序列擴(kuò)增位點(diǎn)分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游．1130、一795、-232、．159、一84和一54處，酶切后連接到pGL3載體上，測序確認(rèn)與與GenBank登錄序列一致然后抽提質(zhì)粒分別與pcDNA3．1(+)和pcDNA3．1(+)．SUFl質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，檢測雙螢光素酶的活性，確定在APOBEC3G啟動子上可能與USFl蛋白結(jié)合的E—box位點(diǎn)