以重組b群腦膜炎奈瑟菌fhbp為載體的結(jié)合疫苗的制備及免疫原性研究

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1、河北北方學(xué)院學(xué)位論文使用授權(quán)及知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬承諾本學(xué)位論文在導(dǎo)師(或指導(dǎo)小組)的指導(dǎo)下，由本人獨(dú)立完成。本學(xué)位論文研究所獲的研究成果，其知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸河北北方學(xué)院所有。河北北方學(xué)院有權(quán)對(duì)本學(xué)位論文進(jìn)行交流、公開和使用。導(dǎo)師簽名譴z呵研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝等內(nèi)容外，文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，指導(dǎo)教師對(duì)此進(jìn)行了審定。本論文由本人獨(dú)立撰寫，文責(zé)自負(fù)。別醛轢霹王凈芝日1‘

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3、????????一1英文摘要?????????????????????????一3英文縮寫?????????????????????????一5研究論文以重組B群腦膜炎奈瑟菌fl-／BP為載體的結(jié)合疫苗的制備及免疫原性研究前言????????????????????????一88月g吾????????????????????????一材料與方法??????????????????????一9結(jié)果???????????????????????··24附圖???????????????????????··26附表???????????????????????一32討論

4、???????????????????????··33結(jié)論???????????????????????··36參考文獻(xiàn)??????????????????????··37綜述B群腦膜炎奈瑟菌疫苗的研發(fā)及挑戰(zhàn)???????-·42致謝????????????????????????··55個(gè)人簡(jiǎn)歷????????????????????????··56中文摘要以重組B群腦膜炎奈瑟茵fHBP為載體的結(jié)合疫苗的制備及免疫原性研究摘要腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis，Nm)是專一人致病的革蘭陰性雙球菌，依據(jù)莢膜多糖的化學(xué)和免疫學(xué)性質(zhì)，可分為13個(gè)

5、血清型(A、B、C、D、H、I、K、L、X、Y、Z、29E、W135)。95％以上的病例為A、B、C、Y和W135五個(gè)血清型所致。盡管A、C、Y、W135群的莢膜多糖(TI一2抗原)免疫原性弱，但將其與蛋白載體結(jié)合后(轉(zhuǎn)變其為TD抗原)，可以誘導(dǎo)出滿意的保護(hù)性。B群莢膜多糖是[N．乙酰神經(jīng)氨酸。Q．(2．8)1，其免疫原性弱，且為自身抗原，即使與蛋白載體結(jié)合也不能取得良好效果。至今，外膜蛋白(outermembraneprotein)疫苗是預(yù)防B群菌株暴發(fā)流行的唯一選擇，但是這類疫苗有株特異性(strainspecific)，只對(duì)流行菌株有保護(hù)性。Nm全基因組測(cè)序

6、后，運(yùn)用反向疫苗學(xué)(reversevaccinology)的方法，發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)在所有B群Nm中均較保守的蛋白，免疫原性強(qiáng)，且保護(hù)性明顯。其中最引人注目的是fHBP(factorHbindingprotein)。以該蛋白為主要成分的疫苗正進(jìn)行臨床試驗(yàn)。本研究以重組B群腦膜炎奈瑟菌外膜蛋白fHBP為載體與c群多糖(groupCmeningococcalpolysaccharide，GCMP)共價(jià)結(jié)合，制備結(jié)合疫苗，免疫小鼠，檢測(cè)小鼠血清中針對(duì)B群和C群腦膜炎奈瑟菌的殺菌抗體，評(píng)價(jià)該重組蛋白作為結(jié)合疫苗載體的可行性及針對(duì)B群Nm的交叉保護(hù)性。研究方法是擴(kuò)增加印并連接至1]

7、pET30a(+)表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化至E．coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，鎳親和層析柱純化rfHBP，CNBr活化法將rfHBP與GCMP共價(jià)結(jié)合，制備結(jié)合疫苗，免疫小鼠，間接ELISA法檢測(cè)血清中GCMP抗體和rfHBP抗體滴度，TTC法檢測(cè)結(jié)合物誘導(dǎo)的分別針對(duì)B群和C群Nm的殺菌抗體水平。本研究成功擴(kuò)增歷如并連接_至pET30a(+)表達(dá)載體上，大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)rfHBP，純化后與GCMP結(jié)合。結(jié)合物免疫小鼠后，檢測(cè)到的針對(duì)GCMP的IgG抗體滴度中文摘要與GCMP組比較有明顯加強(qiáng)效應(yīng)；三針免疫后，針對(duì)C群Nm的殺菌抗體滴度高于GCMP對(duì)照組，有

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(氏0．05)；針對(duì)B群Nm的殺菌抗體滴度與rfHBP對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(胗0．05)；兩組結(jié)合物誘導(dǎo)的分別針對(duì)B群NmCMCC29361株禾1]ATCC700111株的殺菌抗體滴度間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(胗O．05)。結(jié)果顯示結(jié)合疫苗免疫小鼠后檢測(cè)到的針對(duì)C群Nm的殺菌抗體高于單獨(dú)GCMP組，證明該重組蛋白可作為結(jié)合疫苗的載體蛋白；且在結(jié)合過(guò)程中較好地保留了蛋白的免疫原性，對(duì)B群Nm有良好的交叉保護(hù)作用。關(guān)鍵詞：B群腦膜炎奈瑟菌；外膜蛋白；結(jié)合疫苗；H因子結(jié)合蛋白莢文摘要PREPARAl’IONoFMENINGOCOCCALCONJUGATEVACCINEU

9、SINGR