菌影疫苗和淋病奈瑟菌疫苗的制備及其免疫原性初步研究

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1、菌影疫苗和淋病奈瑟菌疫苗的制備及其免疫原性初步研究PreparationofbacterialghostsandNeisseriagonorrhoeaevaccineandprimingstudyontheirimmunogenicity碩士研究生：賀麗導(dǎo)IJi而．焦紅梅副教授揚(yáng)州大學(xué)2013年5月賀麗：菌影疫苗和淋病奈瑟菌疫苗的制各及其免疫原性初步研究菌影疫苗和淋病奈瑟菌疫苗的制備及其免疫原性初步研究摘要IIIIIIIIIIIIIfY2419899細(xì)菌菌影(bacterialghosts，BGs)是革蘭陰性菌在噬菌體PhiXl7

2、4的裂解蛋白E的作用下形成的不含核酸、核糖體及其他組分的細(xì)菌空殼。BGs在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上與天然細(xì)菌保持良好的一致性，菌體表面的脂多糖、肽聚糖等成分可作為天然佐劑，菌影的胞周間隙和細(xì)胞空殼內(nèi)部可接受大量的外源物質(zhì)(女[1DNA、藥物等)，細(xì)菌菌影不僅可直接作為疫苗使用，而且可作為運(yùn)送疫苗和藥物的載體。淋病(Gonorrhea)是由淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)弓l起的性傳播疾病。隨著淋病奈瑟菌耐藥菌株日趨增加，抗生素的治療效果降低或喪失，治療成本也大大增加。新型疫苗的研制對(duì)預(yù)防和控制淋病傳播流行具有重要意義。本

3、課題起初設(shè)計(jì)是借助菌影這種新型載體，裝載淋病奈瑟菌基因疫苗，但由于裝載效率需要進(jìn)一步完善，在此先探索了大腸桿菌和沙門氏菌菌影的制備方法，同時(shí)構(gòu)建了減毒沙門氏菌介導(dǎo)的淋病奈瑟菌基因疫苗，并分別對(duì)其免疫原性進(jìn)行了初步研究，為以后淋病疫苗的研制探路。研究?jī)?nèi)容分為以下三部分：一、大腸桿菌菌影的制備以噬菌體PhiXl74為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出裂解基因E和Em，將裂解基因分別插入到含有)、,pL／pR-ci857調(diào)控系統(tǒng)的pBV220和pBV220m載體中。本部分共構(gòu)建了四個(gè)重組溶菌質(zhì)粒，分別命名為pBV220一E、pBV220m-E、pB

4、V220-Em和pBV220m．Em。經(jīng)42。C熱誘導(dǎo)表達(dá)裂解基因，pBV220．Em裂解效率最高，達(dá)到99％；掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果顯示，細(xì)菌表面有孔，細(xì)菌內(nèi)容物清空形成空殼，表明已成功制備了具有完整外膜的大腸桿菌菌影。將真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1裝載菌影后轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)染效率不高，方法有待改進(jìn)。二、沙門氏菌菌影的制備及其免疫原性初步研究揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文以溶菌質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增溫控溶菌盒(EBOXl／EBOX2)，用限制性內(nèi)切酶(XhoI、SpeI)酶切后重組到pBBRlMCS2載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中。通過(guò)電

5、轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入沙門氏菌HA2中，獲得的重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，pBBRlMCS2．EBOX2裂解效率達(dá)到98．67％。掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果顯示，腸炎沙門氏菌內(nèi)容物流失形成菌影。將6～8周齡的BALB／c小鼠，隨機(jī)分成3組：沙門氏菌HA2菌影組(HA2．BG組)、沙門氏菌HA2滅活菌組、PBS對(duì)照組。HA2．BG組和PBS組通過(guò)口服和滴鼻免疫，HA2滅活菌組以肌肉注射的方式免疫，每?jī)芍苊庖咭淮危裁庖?次。間接ELISA檢測(cè)血清中IgG和糞便中IgA水平。結(jié)果表明，二免兩周后，HA2一BG組和HA2滅活菌組血清中IgG含量顯

6、著高于PBS組(P

7、鼠巨噬細(xì)胞RAW264．7，RT-PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)可檢測(cè)出NspA基因和PorB基因在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)。將重組真核表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化減毒沙門氏菌SL7207，構(gòu)建出重組沙門氏菌SL7207(pVAXl-NspA)和SL7207(pVAXl．PorB)。將6～8周齡的BALB／c小鼠隨機(jī)分為五組：SL7207(pVAXl一NspA)組、SL7207(pVAXl-PorB)組、SL7207(pVAXl-NspA)+SL7207(pVAXl．PorB)組、SL7207(pVAXl)組和PBS組，每組滴鼻151服免疫1×10

8、9CFU，間接ELISA檢測(cè)抗體。結(jié)果顯示，各重組菌SL7207(pVAXl．NspA)組、SL7207(pVAXl．PorB)組、SL7207(pVAXl-NspA)+SL7207(pVAXl．PorB)組在一免兩周后就能檢測(cè)到血清中IgG和糞便