資源描述：
《淋病奈瑟菌porb-1tb核酸疫苗構(gòu)建及其免疫活性初步的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、淋病奈瑟菌porB．1tB核酸疫苗的構(gòu)建及其免疫活性的初步研究碩士研究生：陳敏導(dǎo)師：胡四海教授中文摘要【目的】構(gòu)建pET30a／porB、pET30a／ltB、pET30a／ltB-porB原核重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E．coilBL21表達(dá)重組融合蛋白，分析蛋白的免疫原性和抗原性；構(gòu)建pcDNA3．1(-)／porB、pcDNA3．1(-ⅥtB、pcDNA3．1(-)／ltB-porB真核重組質(zhì)粒，鼻飼免疫BALB／c小鼠，比較分析核酸疫苗的免疫活性，為研制淋病核酸疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！痉椒ā縋CR法分別擴(kuò)增目的基因p
2、orB、ltB、ltB-porB，采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建pET30a／porB、pET30a／ltB、pET30a／ltB-porB原核重組質(zhì)粒和pcDNA3．1(一)11)0m、．pcDNA3．1(-)／1tB、pcDNA3．1(-)／ltB-porB真核重組質(zhì)粒，PCR、雙酶切及基因測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。原核重組質(zhì)粒pET30a／porB、pET30a／ltB、pET30dltB—porB轉(zhuǎn)入E．coliBL21中，0．8mmol／LIPTG誘導(dǎo)帶6-His的融合重組蛋白的表達(dá)，用帶6-His組氨酸
3、標(biāo)簽的鎳一瓊脂純化柱純化重組融合蛋白，尿素濃度梯度法(6M-4M．2M．1M．0M)復(fù)性重組融合蛋白，Westem-blot分析蛋白抗原性。免疫新西蘭兔四次后，收集血清，間接ELISA法分析復(fù)性重組融合蛋白的免疫原性。pcDNA3．1(·)／porB、pcDNA3．1(-妒tB-porB、pcDNA3．1(．妒tB真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，用細(xì)胞免疫熒光法鑒定質(zhì)粒在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。核酸疫苗pcDNA3．1(-)／porB、pcDNA3．1(-)／ltB-porB鼻飼免疫BALB／c小鼠，同時(shí)設(shè)對(duì)照組pc
4、DNA3．1(一)／ltB、pcDNA3．1(-)和PBS組，每次免疫后2w即下一次免疫前一天行小鼠尾靜脈采血，分離血清，間接ELISA法檢測(cè)血清中抗PorB的特異性IgG水平，沖洗小鼠生殖道，收集生殖道沖洗液，間接ELISA法檢測(cè)沖洗液中抗PorB的特異性sIgA水平。末次免疫后2W取小鼠脾細(xì)胞于37"C5％C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖。小鼠生殖道粘膜用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PorB、LTB、LTB．PorB蛋白在體內(nèi)的表達(dá)。．【結(jié)果】構(gòu)建的pET30a／porB、pET30a／ltB、pE
5、T30a／ltB—porB原核重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E．coliBL21，IPTG誘導(dǎo)后均獲得了重組融合蛋白表達(dá)，Western．blot分析表達(dá)的蛋白均有較強(qiáng)3的抗原性，能與抗PorB的特異性抗體結(jié)合。構(gòu)建的pcDNA3．1(-)／porB、pcDNA3．1(加tB、peDNA3．1(-)／ltB-porB真核重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光法鑒定重組蛋白，均能在真核細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)；核酸疫苗pcDNA3．1(一)／porB、pcDNA3．1(-)ntB、pcDNA3．1(一)／ltB-porB經(jīng)鼻飼免疫BA
6、LB／c小鼠，末次免疫后2w取鼻部粘膜組織免疫組織化學(xué)法檢測(cè)到重組蛋白能在小鼠鼻粘膜組織內(nèi)表達(dá)。小鼠的生殖道沖洗液中能檢測(cè)到抗PorB的特異性slgA，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的slgA水平明顯增高(尺0．01)，且含粘膜佐劑的pcDNA3．1(-ⅥtB—porB組較單基因pcDNA3．1(-)／porB組高(尺O．05)。實(shí)驗(yàn)組血清中抗PorB的IgG抗體，與對(duì)照組相比有明顯差異(尺0．os)，但是pcDNA3．1(-MtB．porB組與單基因pcDNA3．1(-)／porB組比較則無(wú)差異(乃0．05)。與對(duì)照
7、組相比，實(shí)驗(yàn)組脾細(xì)胞增殖程度無(wú)明顯升高(乃O．05)【結(jié)論】1．成功克隆TporB和ltB基因，并將兩者融合，構(gòu)建TItB、porB、以及l(fā)tB-porB融合基因+pET30a原核表達(dá)載體，目的基因均在E．coliBL21中表達(dá)出相應(yīng)的重組融合蛋白，制備出高純度的具有較強(qiáng)免疫原性和抗原性的融合蛋白。’2．成功構(gòu)建TltB、porB、以及l(fā)tBl弦rB融合基因pcDNA3．1(．)真核表達(dá)載體，并分別在Hela細(xì)胞中獲得表達(dá)。3．所構(gòu)建的pcDNA3．1(-)／porB、pcDNA3．1(-)／1tB—porB
8、核酸疫苗，經(jīng)粘膜途徑免疫能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫反應(yīng)，尤其是黏膜免疫應(yīng)答。4．首次證實(shí)LTB作為黏膜佐劑與PorB融合，通過(guò)鼻黏膜免疫后能提高PorB誘導(dǎo)的特異性sIgA水平?！娟P(guān)鍵詞】淋病奈瑟菌；PorB蛋白；粘膜佐劑LTB：融合蛋白：核酸疫苗基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(No．30771931)4^·‘n’‘●1●?一一一-一Construction0InncleicaCldVacclnew
