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《可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1（sflt-1）對結(jié)腸癌細胞生長抑制作用實驗的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1(sFlt一1)對結(jié)腸癌細胞生長抑制作用的實驗研究【背景及目的】專業(yè)：外科學(xué)學(xué)位申請人：吳榮耀導(dǎo)師：鄭朝旭副教授摘要結(jié)腸癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，居我國因腫瘤而致死亡原因的第四位，而且發(fā)病率有逐年上升的趨勢。盡管當前的常規(guī)治療手段，包括手術(shù)及放療、化療能在一定程度上緩解患者的痛苦，延長其壽命，但總的治療效果還是不能讓人滿意。因此，迫切需要發(fā)展或聯(lián)合新的治療方法或新的治療策略。以往的研究結(jié)果表明，腫瘤新生血管的形成不僅與結(jié)腸癌細胞的生長、增殖關(guān)系密切，而且與癌細胞的遠處器官的轉(zhuǎn)移也緊密相關(guān)，并可作為結(jié)
2、腸癌治療的一個獨立的預(yù)后因素。因此，針對腫瘤新生血管的形成己成為目前結(jié)腸癌治療中的一個新靶點。腫瘤新生血管的形成受多種因素的影響，其中血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是目前已知的最強的血管生成促進因子，它通過與其相應(yīng)受體Fh。l(fms．1iketyrosinekinase—l，F(xiàn)it．1)及Flk．1／KDR(fetalliverkinase．1，F(xiàn)lk-1／kinaseinsertdomain—containingreceptor,KDR)相結(jié)合是發(fā)揮其促血管生成的功能，其中Fit—l與V
3、EGF的親和力比Flk一1高7—10倍。據(jù)報道，VEGF在正常腸上皮細胞中不表達或極低表達，與之相反，對結(jié)腸癌腫瘤標本的研究顯示，VEGF在癌組織中高表達，結(jié)腸癌細胞可分泌大量的VEGF；進一步的研究顯示，VEGF在癌組織中的表達水平與患者TMN分期以及預(yù)后密切相關(guān)。這些研究為下一步針對VEGF及其受體為靶點的治療打下了良好的理論基礎(chǔ)。中山大學(xué)碩士學(xué)位論文可溶性Fit．1(solubleFit-1，sFlt．1)是一種體內(nèi)天然存在的、低表達豐度的VEGF拮抗劑，是內(nèi)源性表達的Fit．1的剪切形式。sFlt．1缺少Fit．1的跨膜部分和胞內(nèi)部分，與VEG
4、F結(jié)合后，不具備酪氨酸激酶的活性，可以抑制VEGF的促血管生成的生物學(xué)功能。已有研究證實，sFlt．1的第1．3個Ig樣結(jié)構(gòu)區(qū)域為與VEGF結(jié)合所必需，且等同于全長sFlt—l與VEGF的結(jié)合能力。應(yīng)用sFlt—l對抗血管生成，是治療腫瘤是理想的選擇?；谝陨纤觯琕EGF及其受體在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。針對VEGF及sFlt-1為靶點治療結(jié)腸癌有著光明的前景。本研究針對sFlt一1這種天然存在的強大的VEGF拮抗劑，體外克隆構(gòu)建sFlt—l的第1．3個Ig樣結(jié)構(gòu)區(qū)域，將其與真核載體pcDNA3．0連接后，轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoVo細胞，探討其對
5、結(jié)腸癌LOVo細胞生長增殖的影響?！狙芯糠椒ā?．應(yīng)用RT-PCR的方法從人臍血靜脈內(nèi)皮細胞中擴增sFlt．1基因的第1—3個Ig樣結(jié)構(gòu)區(qū)域，并將其克隆至TA載體中。對TA克隆中的sFlt．1基因進行酶切及PCR鑒定，并測序。陽性克隆命名為T-sFlt。2．應(yīng)用PCR的方法從T-sFlt質(zhì)粒擴增sFlt．1基因，并將其與真核載體pcDNA3．0連接，構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pcDNA．sFlt。應(yīng)用酶切鑒定、PCR、DNA測序的方法，對重組體進行鑒定。3．通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)重組體pcDNA—sFlt轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoVo細胞。對轉(zhuǎn)染后
6、篩選出的陽性細胞克隆，應(yīng)用RT-PCT的方法檢測sFlt．1mRNA的表達，應(yīng)該ELISA的方法檢測sFlt．1蛋白的表達。4．應(yīng)用MTT法檢測轉(zhuǎn)染后的細胞上清對LoVo細胞生長情況的影響，同時用ELISA法檢測不同轉(zhuǎn)染時間段LoVo細胞上清中VEGF濃度的變化?！緦嶒灲Y(jié)果】1．以RT-PCR的方法從人臍血靜脈內(nèi)皮細胞中成功擴增出大小約1000bp的DNA片段；其與TA克隆載體連接后，經(jīng)酶切及PCR鑒定，電泳結(jié)果表明有目的基因片段的插入；對T-sFlt重組質(zhì)粒進行測序鑒定，測序結(jié)果同GenBank上的Fit—l的基因序列進行比對，完全吻合，未發(fā)現(xiàn)任何堿
7、基突變。II中山大學(xué)碩士學(xué)位論文2．以PCR的方法從T-sFlt重組質(zhì)粒中成功擴增出大小約1000bp的DNA片段，與預(yù)計相符；PCR產(chǎn)物與真核載體pcDNA3．0連接后，經(jīng)酶切及PCR鑒定，顯示有目的基因片段的插入；對pcDNA．sFlt重組質(zhì)粒進行測序鑒定，測序結(jié)果與GenBank上的Fit．1的基因序列進行比對，完全吻合，未發(fā)現(xiàn)堿基突變。3．pcDNA—sFlt重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌Lov0細胞后RT-PCR檢測目的基因mRNA表達，電泳可見目的基因條帶，說明有轉(zhuǎn)錄水平上的表達。ELISA檢測到細胞培養(yǎng)上清中sFlt．1重組蛋白，說明轉(zhuǎn)染后的LoVo
8、細胞能表達sFlt一1并將其分泌到上清中，分泌量48小時達到高峰。4．各轉(zhuǎn)染時段的細胞培養(yǎng)上清
