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1、肖煒明：漢黃芩素對(duì)胃癌生長(zhǎng)及細(xì)胞免疫功能影響的研究1漢黃芩素對(duì)胃癌生長(zhǎng)及細(xì)胞免疫功能影響的研究中文摘要漢黃芩素(wogonin)是半枝蓮的主要活性成分之一，為一種天然黃酮類化合物，分子式為C16H1205，具有抗氧化、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)靜和廣泛的抗腫瘤活性等作用。然而，漢黃芩素抗腫瘤活性的研究多集中于體外觀察其對(duì)腫瘤的細(xì)胞毒活性，體內(nèi)應(yīng)用漢黃芩素是否具有抗胃癌活性、以及漢黃芩素在殺傷胃癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)機(jī)體樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)和T／NK淋巴細(xì)胞功能的影響如何，期待深入研究。本文首先基于胃癌臨床資料，觀察人體胃癌組織VEGF
2、表達(dá)、血清VEGF濃度分別與局部腫瘤DCs浸潤(rùn)及其活性的關(guān)聯(lián)；其次基于小鼠荷瘤模型，明確漢黃芩素是否具有抑制胃癌生長(zhǎng)，以及荷瘤小鼠經(jīng)漢黃芩素治療后體內(nèi)細(xì)胞免疫功能的變化；并分析漢黃芩素對(duì)生理狀態(tài)及胃癌微環(huán)境中樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)活性的影響及其機(jī)制；最后觀察漢黃芩素直接對(duì)T細(xì)胞和NK細(xì)胞功能的影響，以及是否協(xié)同DSS誘導(dǎo)小鼠腸炎的發(fā)病，從而深入闡明漢黃芩素體內(nèi)抗腫瘤活性的機(jī)制。研究?jī)?nèi)容分為4部分：1．胃癌組織VEGF表達(dá)及血清VEGF濃度與DC浸潤(rùn)及其活性的關(guān)聯(lián)分析目的：分析胃癌患者腫瘤組織VEGF表達(dá)、血清VEGF濃
3、度對(duì)腫瘤組織內(nèi)DCs浸潤(rùn)及其活性的關(guān)聯(lián)，明確VEGF對(duì)DC表達(dá)CD86的影響。方法：應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)胃癌組織腫瘤細(xì)胞和CDllc+細(xì)胞VEGF的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清VEGF的濃度。分離胃癌患者和健康個(gè)體外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，利用GM—CSF和IL．4體外誘導(dǎo)為DC，比較兩組人群DC表面HLA．DR和CD86的表達(dá)。最后用重組VEGF蛋白體外刺激DC，觀察VEGF對(duì)DC表達(dá)CD86的影響。結(jié)果：胃痛組織VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，VEGF表達(dá)強(qiáng)度與DC浸潤(rùn)程度呈反向關(guān)聯(lián)。VE
4、GF的表達(dá)與胃癌的大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈正相關(guān)。CDllc+DC密度的浸潤(rùn)密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期呈負(fù)相關(guān)。胃癌組織rflCDllc+VEGF+雙陽(yáng)性細(xì)胞頻率明顯高于癌旁組織。CDllc+VEGF+細(xì)胞密度與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均正相關(guān)。胃癌患者血清內(nèi)VEGF濃度明顯高于健康個(gè)體。與健康個(gè)體相比，胃癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源DC表面HLA．DR和CD86的表達(dá)均降低。重組VEGF下調(diào)胃癌患者DC表面CD86的表達(dá)。結(jié)論：胃癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤組織DC浸潤(rùn)密度呈負(fù)相關(guān)，而胃癌患者血2
5、揚(yáng)』、I'1大學(xué)博士學(xué)位論文清高濃度VEGF與其外周血單核細(xì)胞來(lái)源DC表面HLA—DR和CD86的表達(dá)降低有關(guān)，腫瘤組織分泌VEGF的DC頻率與胃癌進(jìn)展呈正相關(guān)。提示采取靶向抑制腫瘤細(xì)胞分泌VEGF和增強(qiáng)DC功能的治療方法，可取得較好的抗腫瘤治療效果。2．漢黃芩素抑制胃癌及免疫增強(qiáng)雙向調(diào)節(jié)活性及初步機(jī)制目的：體外觀察漢黃芩素對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡、VEGF分泌、MHCI類相關(guān)抗原A(MICA)和B7H1表達(dá)的影響，分析漢黃芩素處理胃癌細(xì)胞后形成的凋亡小體是否易于被DC吞噬，基于小鼠移植瘤模型明確漢黃芩素體內(nèi)抗胃癌生長(zhǎng)的活性
6、及對(duì)腫瘤微環(huán)境中淋巴細(xì)胞的影響。方法：首先在SGC一7901和MFC細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，分別加入不同濃度漢黃芩素9陣育12小時(shí)，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)胃癌細(xì)胞的凋亡情況。另外，用ELISA方法分別檢測(cè)胃癌細(xì)胞上清液中VEGF、HMGBl的分泌，F(xiàn)CM檢測(cè)腫瘤細(xì)胞CRT、MICA、B7H1的表達(dá)。其次分離胃癌患者外周血PMBC，誘導(dǎo)成未成熟DC，將漢黃芩素各組處理后的SGC．7901細(xì)胞與iDC共培養(yǎng)48小時(shí)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組CDllc+CFSE+細(xì)胞的表達(dá)。取胃癌MFC細(xì)胞，以1×106／ml／接種于615小鼠
7、腋下成瘤。以不同劑量腹腔注射漢黃芩素，每天1次，連續(xù)3周，觀察腫瘤組織生長(zhǎng)及小鼠存活情況。最后，F(xiàn)CM檢測(cè)小鼠移植瘤組織及脾臟中CD4+T、CD8+T、NK細(xì)胞的頻率：免疫熒光法檢測(cè)小鼠移植瘤組織中VEGF、RAE．1、B7H1的表達(dá)和CD4+、CD8+T、NK細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。結(jié)果：漢黃芩素呈劑量依賴性誘導(dǎo)胃癌SGC．7901細(xì)胞和MFC細(xì)胞的凋亡，抑制胃癌SGC一7901和MFC細(xì)胞分泌VEGF，下調(diào)胃痛SGC．7901和MFC細(xì)胞表面B7H1和MICA(RAE．1)的表達(dá)。另外，漢黃芩素處理后的SGC一7901
8、細(xì)胞形成的凋亡小體易被未成熟DC吞噬。漢黃芩素體內(nèi)應(yīng)用抑制胃癌移植瘤生長(zhǎng)，在50mg／kg劑量組較為明顯，且50mg／kg劑量組能顯著延長(zhǎng)615小鼠的生存期；漢黃芩素治療組的荷瘤小鼠脾臟及腫瘤組織內(nèi)CD4+T、CD8+T、NK細(xì)胞的頻率增高，且漢黃芩素治療組腫瘤組織表達(dá)VEGF、RAE一1、B7Hl下降。結(jié)論：漢黃芩素不僅具有直接誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的活性，還可
