MicroRNA-204在角膜新生血管中的表達及其作用研究.pdf

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1、分類號：R5密級：公開學校代碼：11065學號：2015010040學術(shù)博士學位論文MicroRNA-204在角膜新生血管中的表達及其作用研究作者姓名張曉萍指導(dǎo)教師史偉云主任醫(yī)師學科眼科學培養(yǎng)單位醫(yī)學部臨床醫(yī)學系答辯日期2018年5月20日MicroRNA-204在角膜新生血管中的表達及其作用研究摘要目的角膜無血管化狀態(tài)維持著角膜的免疫赦免和透明性，眼外傷、感染、角膜移植等可引起角膜新生血管，影響視力甚至致盲，角膜新生血管也是引起角膜移植免疫排斥發(fā)生的重要原因。針對角膜新生血管發(fā)生過程中的炎癥和血管內(nèi)皮細胞變化，發(fā)展

2、了諸多抑制角膜新生血管的藥物及方法，如糖皮質(zhì)激素、FK506、抗VEGF等。常規(guī)縫線誘導(dǎo)角膜新生血管模型中存在角膜張應(yīng)力的變化，張應(yīng)力變化會誘導(dǎo)角膜中VEGF水平的升高，從而誘導(dǎo)角膜新生血管，但對于張應(yīng)力如何調(diào)控角膜VEGF表達，進而影響角膜新生血管的機制還不明確。本研究擬檢測已知的microRNAs在縫線和堿燒傷誘導(dǎo)的兩種小鼠角膜新生血管模型中的表達變化，篩選出變化最為明顯的microRNA；通過縫線誘導(dǎo)的小鼠角膜新生血管模型，檢測該microRNA的表達定位，及其對新生血管形成的影響和機制；進一步通過體外培養(yǎng)人角

3、膜上皮細胞和微血管內(nèi)皮細胞，觀察張應(yīng)力變化對該microRNA表達及其對微血管內(nèi)皮細胞的影響。方法1.堿燒傷和縫線誘導(dǎo)的角膜新生血管中microRNAs的表達變化選擇成年6~8周齡BALB/c小鼠為實驗動物，堿燒傷模型采用浸潤1N氫氧化鈉的濾紙（直徑2mm）置于角膜中央，作用40秒后，立即以生理鹽水沖洗40秒，眼表涂氧氟沙星眼膏；縫線模型采用11-0線在角膜旁中央?yún)^(qū)板層放射狀縫合2針；術(shù)后10天取角膜，RT-PCR檢測角膜中miR-10a、16、24、101a、126b、184、200b、204的表達情況。2.角膜新

4、生血管中miR-204的表達變化和定位建立小鼠角膜縫線模型，術(shù)后通過裂隙燈觀察新生血管生長情況，術(shù)后10天拆除縫線，觀察至20天取角膜；RT-PCR分別檢測角膜上皮和基質(zhì)中miR-204的表達情況。取人正常角膜和人新生血管化的病變角膜，RT-PCR檢測角膜上皮中miR-204的表達情況。取人正常角膜、人新生血管化的病變角膜、正常小鼠角膜和新生血管化小鼠角膜，用原位雜交法檢測miR-204在角膜中的表達位置。I3.MiR-204對角膜新生血管的影響建立角膜縫線模型，將角膜縫線小鼠隨機分為（1）PBS組：結(jié)膜下注射PBS

5、；（2）NTC組：結(jié)膜下注射NTC（agomirnegativecontrol）；（3）miR-204agomir組：分別在縫線0天、3天、6天結(jié)膜下注射。術(shù)后3天、5天、7天、10天裂隙燈顯微鏡觀察，術(shù)后10天取角膜；CD31標記角膜新生血管，角膜鋪片統(tǒng)計并比較角膜新生血管面積；免疫組織化學和Westernblot檢測VEGF-A、VEGF-C、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3的表達變化。4.MiR-204對人角膜上皮細胞VEGF-A表達的影響體外培養(yǎng)人原代角膜上皮細胞，分為（1）正常對照組；（2）加力+N

6、TC組；（3）加力+miR-204agomir組；以Flexcell加力裝置對細胞進行張應(yīng)力作用（拉伸度5%，頻率為1Hz，6小時），收取細胞，RT-PCR檢測miR-204及VEGF-A的表達變化，Westernblot檢測VEGF-A蛋白水平的變化。5.MiR-204對人微血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移及成管能力的影響體外培養(yǎng)人微血管內(nèi)皮細胞，分為（1）正常對照組；（2）NTC組；（3）miR-204agomir組；培養(yǎng)基中加NTC或miR-204agomir處理后，CCK8法檢測細胞增殖力、劃痕法比較細胞遷移面積以及統(tǒng)

7、計成管能力。結(jié)果1.角膜新生血管中microRNAs的表達變化在縫線誘導(dǎo)的角膜新生血管模型中，術(shù)后第3天角膜緣即出現(xiàn)新生血管芽，到第10天時角膜水腫，血管生長旺盛，到達縫線位置甚至超越縫線；10天RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)：miR-16、24、126b、184、200b、204低表達，miR-10a、101a表達無明顯變化。在堿燒傷誘導(dǎo)的角膜新生血管模型中，術(shù)后2~3天角膜緣出現(xiàn)新生血管，10天取角膜RT-PCR檢測，與正常角膜比較，新生血管化角膜中：miR-10a、16、24、184、204低表達，miR-126b、20

8、0b高表達，miR-101a表達無明顯變化。2.MiR-204在新生血管化角膜中的表達變化角膜縫線10天時，角膜新生血管生長旺盛，RT-PCR檢測到miR-204的表達水平明顯低于正常角膜（p<0.05）；而且，與角膜松縫線比較，角膜緊縫線誘發(fā)更多的新生血管生長、miR-204降低更明顯。10天拆除角膜縫線，觀察至20天血管明顯消退，取角膜，R