引起急性肝胰腺壞死病的副溶血性弧菌MLST及耐藥性研究

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1、上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文學(xué)校代碼：10264研究生學(xué)號(hào)：M150208411上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文題目：引起急性肝胰腺壞死病的副溶血性弧菌MLST及耐藥性研究Multilocussequencetypingandantibiotic英文題目：resistanceanlysisofAHPND-causingVibrioparahaemolyticus專業(yè)：食品科學(xué)與工程研究方向：食品安全姓名：孫明玉指導(dǎo)教師：趙勇二O一八年五月二十七日上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文上海海洋大學(xué)學(xué)

2、位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：我恪守學(xué)術(shù)道德，崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫(xiě)，我對(duì)所寫(xiě)的內(nèi)容負(fù)責(zé)，并完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：日期：年月日上海海洋大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查

3、閱或借閱。本人授權(quán)上海海洋大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密□，在年解密后適用本版權(quán)書(shū)。本學(xué)位論文屬于不保密□學(xué)位論文作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯委員會(huì)成員名單姓名工作單位職稱備注答辯地點(diǎn)答辯日期上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文引起急性肝胰腺壞死病的副溶血性弧菌MLST及耐藥性研究摘要對(duì)蝦急性肝胰臟壞

4、死?。╝cutehepatopancreaticnecrosisdisease，AHPND）2009年首次在中國(guó)暴發(fā)，之后越南（2010），馬來(lái)西亞（2011），泰國(guó)（2012）和墨西哥（2013）菲律賓（2015）等地接連發(fā)生。這是一種細(xì)菌性疾病，患病對(duì)蝦死亡率極高（高達(dá)100%）。截止到2013年，AHPND給亞洲的對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了前所未有的危害，致使每年經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)10億美元，并且仍有進(jìn)一步擴(kuò)大的趨勢(shì)。2013年Lightner等研究發(fā)現(xiàn)引起AHPND的元兇是一種被噬菌體病毒感染后發(fā)生了

5、變異的副溶血性弧菌。2015年臺(tái)灣的研究小組選擇自然缺失與實(shí)驗(yàn)刪除pirA和pirB毒力基因的突變株進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩類突變株致病能力均消除，為此進(jìn)一步證實(shí)PirA和PirB毒素是引起急性肝胰腺壞死病的最終病因。在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上，發(fā)展面向凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病的高效診斷及防控技術(shù)研究，是減少AHPND疫情的風(fēng)險(xiǎn)，使蝦農(nóng)受益的關(guān)鍵。本課題從AHPND的診斷入手，建立熒光原位雜交檢測(cè)方法，可視化的監(jiān)測(cè)環(huán)境及對(duì)蝦組織中的致病菌，進(jìn)一步證實(shí)本實(shí)驗(yàn)室保存的AHPND菌株具有致病性。其次是以該致病株為實(shí)

6、驗(yàn)材料，并下載國(guó)際上其他地區(qū)AHPND致病株的管家基因信息，分析全球范圍內(nèi)AHPND致病菌的流行性和遺傳學(xué)關(guān)系。最后我們從基因型和表型兩方面研究AHPND致病菌的耐藥性，為促進(jìn)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)，這對(duì)我國(guó)的水產(chǎn)生態(tài)安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.VPAHPND熒光原位雜交檢測(cè)方法的建立本研究基于pirA基因設(shè)計(jì)熒光原位雜交探針，檢測(cè)引起對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病的副溶血性弧菌。通過(guò)序列比對(duì)軟件ClustalX發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的pirA基因保守?zé)o突變，采用PrimerPremier5軟

7、件設(shè)計(jì)探針。探針核酸序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST選項(xiàng)初步檢驗(yàn)不匹配他種屬非AHPND菌株。為進(jìn)一步驗(yàn)證其特異性，選取21株非AHPND致病菌和12株AHPND致病菌進(jìn)行驗(yàn)證，F(xiàn)ISH檢測(cè)可以鑒別出12個(gè)AHPND陽(yáng)性樣本，與PCR檢測(cè)方法結(jié)果一致。本研究設(shè)計(jì)的pirA探針與AHPND致病性的副溶血性弧菌雜交時(shí)，熒光信號(hào)清晰，菌體形狀明顯。同時(shí)用pirA探針檢測(cè)患病對(duì)蝦肝胰腺切片時(shí)看到有明顯的致病菌存在。FISH可以用來(lái)檢測(cè)環(huán)境和蝦組織中的AHPND致病性的副溶血性弧菌。本研究將為更好地了解這

8、些環(huán)境微生物對(duì)水產(chǎn)品的危害提供更多的工具。I上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文2.引起凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病的副溶血弧菌MLST新序列型本研究針對(duì)不用地區(qū)急性肝胰腺壞死病致病性副溶血弧菌，運(yùn)用多位點(diǎn)測(cè)序技術(shù)，分析了致病菌株的遺傳特征。實(shí)驗(yàn)選擇副溶血弧菌的7個(gè)管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC及tnaA，對(duì)AHPND致病菌擴(kuò)增測(cè)序。將核酸序列上傳至PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后獲得每株菌的序列型。同時(shí)收集不同地區(qū)AHPND致病性副溶血弧菌的MLST數(shù)據(jù)，采用eBURSTV