新肝癌相關(guān)基因hta功能的初步研究

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1、中圖分類號——UDC610博士學位論文學校代碼!Q至三三密級公玨新肝癌相關(guān)基因HTA功能的初步研究Th,preliminyfunctionstudyof’hepatomaIIerellmlnaryunCtionstuanovelheatomaassociatedgeneHTA0ciateue1作者姓名：學科專業(yè)：研究方向：學院(系、所)：指導教師：論文答辯日期絲!≥!!．鯊劉艷紅病理學與病理生理學基因工程抗體與腫瘤免疫治療腫瘤研究所李官成教授答辯委員會主席選中南大學二0一三年五月原創(chuàng)性聲明本人聲明，所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了論文中特別

2、加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中南大學或其他單位的學位或證書而使用過的材料。與我共同工作的同志對本研究所作的貢獻均已在論文中作了明確的說明。作者簽名：魚l圭邊日期：趁!；年—L月二墨_日學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人了解中南大學有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權(quán)保留學位論文并根據(jù)國家或湖南省有關(guān)部門規(guī)定送交學位論文，允許學位論文被查閱和借閱；學?？梢怨紝W位論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用復印、縮印或其它手段保存學位論文。同時授權(quán)中國科學技術(shù)信息研究所將本學位論文收錄到《中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫》，并通過網(wǎng)絡(luò)向社會公眾提供信息服務(wù)。博

3、士學位論文中文摘要新肝癌相關(guān)基因HTA功能的初步研究摘要研究背景與目的肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是發(fā)病率高、惡性程度高、預后差的惡性腫瘤，其發(fā)病機制涉及多基因調(diào)控、多信號通路參與，是一個復雜的網(wǎng)絡(luò)體系，其根源是基因表達異常。肝癌的傳統(tǒng)治療效果不理想，免疫治療和基因治療現(xiàn)已成為研究熱點，在肝癌中異常表達的基因是其理論基礎(chǔ)的核心。發(fā)現(xiàn)和研究新的具有應(yīng)用前景的腫瘤相關(guān)基因仍是腫瘤研究的重要領(lǐng)域和難題。聚焦于肝癌相關(guān)基因的研究有望為肝癌的早期診斷、分子免疫治療及預后分析提供有力的工具。對肝癌相關(guān)基因功能機制的深入研究不僅能豐富肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制和理論體系，

4、更重要的是為肝癌的臨床診斷和治療提供有力的標志物和靶點。HTA基因是本實驗室通過生物信息學方法篩選得到的新肝癌相關(guān)基因，前期實驗結(jié)果表明HTA基因不僅是一種特異性較強的腫瘤標志物，而且在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起促進作用，故有望將其應(yīng)用于肝癌的診斷和免疫治療。同時，正因為HTA基因是從EST文庫中新篩選發(fā)現(xiàn)的肝癌相關(guān)基因，前期研究只對其表達的特異性和促癌作用有了初步認識，但是關(guān)于該基因結(jié)構(gòu)和功能機制方面的研究尚未開展，因此，本課題擬通過RACE和Northernblot等方法克隆HTA本課題受如下基金資助：1．國家自然科學基金，肝癌相關(guān)基因HTA的功能研究批準號：812019032．湖南省研究生

5、科研創(chuàng)新項目肝癌新標志物HTA的功能初步研究批準號：CX20118050TT博士學位論文中文摘要基因的全長并對其進行結(jié)構(gòu)分析，對HTA基因編碼的蛋白進行表達、純化并制備單抗，用過表達手段研究HTA基因在肝癌細胞系的中的功能，并結(jié)合基因芯片、酵母雙雜交、westernblot等多種細胞生物學、分子生物學、生物信息學、實驗動物學等研究手段和策略深入探討HTA基因在肝癌中的作用機制。方法(1)RACEPCR擴增HTA基因的全長并對其基因結(jié)構(gòu)、可變剪接進行分析，對其編碼蛋白的特點進行預測。Northernblot檢測HTA不同轉(zhuǎn)錄本在肝癌細胞系及正常細胞系中的表達。(2)構(gòu)建原核表達載體，在大腸

6、桿菌Rosetta中表達GST-HTA融合蛋白，用GST瓊脂糖凝膠對融合蛋白進行純化并用凝血酶切除GST標簽，獲得具有生物活性的HTA蛋白。以HTA蛋白為抗原，用雜交瘤技術(shù)制各單克隆抗體并鑒定。以該抗體用于westernblot、免疫細胞化學檢測HTA在肝癌細胞中的表達，并初步研究HTA抗體抑制肝癌細胞系增殖的生物學功能。(3)構(gòu)建HTA真核表達載體，在肝癌細胞系HepG2及HTA表達量較弱的肝癌宿主肝細胞系QSG．7701中穩(wěn)定過表達HTA基因，通過細胞增殖實驗、細胞周期檢測、克隆形成實驗、裸鼠成瘤實驗等體內(nèi)外實驗檢測HTA基因過表達對肝癌細胞系生物學表型的影響。(4)以干擾HTA基因

7、前后的HepG2細胞系總RNA為材料，全基因組表達譜芯片雜交篩選HTA相關(guān)差異基因。生物信息學GO分析和pathway分析HTA的相關(guān)差異基因及信號通路，實時熒光定量PCR和westernblot檢測感興趣的HTA相關(guān)差異基因，明膠酶譜實驗、細胞粘附實驗、侵襲轉(zhuǎn)移實驗等進一步驗證HTA基因的生物III博士學位論文中文摘要學功能。(5)以HTA蛋白為誘餌，在標準化人cDNA文庫中，用酵母雙雜交方法篩選HTA的相互作用蛋白。結(jié)合生物信息