rna干涉抑制htert對人腦膠質瘤細胞生長影響及機制的研究論文

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1、縮略詞RNAi英文全稱英文縮略詞表shRNAsmallhairpinRNA中文全稱RNA干涉小片段干涉RNA小片段發(fā)卡樣RNAhTERThumantelomerasereversetranscriptase人端粒酶逆轉錄酶RISC西豫口1RNA-inducingsilencingcomplexRNA誘導沉默復合物humantelomeraseRNA人端粒酶RNAtelomeraseassociatedproteinl端粒酶相關蛋白1GAPDHglyceraldehydephosphatedehydrogenase磷酸甘油醛脫氫酶TRAPtelomericrepeatamplificati

2、onprotocol端粒重復序列擴增法MOIFISHPNAmultiplicityofinfection感染復數(shù)fluorescenceinsituhybridization熒光原位雜交peptidenucleicacid核酸肽直贏匡抖盍堂簋±堂僮途童論文獨創(chuàng)性聲明本論文坐王造控劍墮!墾墼撾照廈擅麴照生籃整墮丞扭里盟至L是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。論文中除了特別加以標注和致謝的地方外，不包含其他人或機構已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對本研究的啟發(fā)和所做的貢獻均在論文中作了明確的聲明并表示了謝意。專業(yè)：拉經(jīng)生I型作者簽名：血盈咯日期：論文使用授權聲明本人完全了

3、解南京醫(yī)科大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權保留送交論文的復印件，允許論文被查閱和借閱；學?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨热荩梢圆捎糜坝?、縮印或其它復制手段保存論文。保密的論文在解密后遵守此規(guī)定。作者簽名：導師簽名：j弛日期：RNA干涉抑制hTERT對人腦膠質瘤細胞生長影響及機制研究第—部分：靶向hTERT小片段干涉RNA表達載體的構建和表達【目的】構建靶向hTERT的小片段鼢艙(siRNA)表達載體，為研究RNA干涉(RNAi)在哺乳動物細胞內抑制靶基因表達奠定基礎．I方法】根據(jù)siRNA靶點設計的原則運用相關軟件設計靶序列并合成其表達框，連接入質粒載體pRNAT-H1．1／

4、Neo，轉染293T細胞，熒光定量RT-PCR和westernblot法檢測轉染后293T細胞中hTERT表達?！窘Y果】重組質粒經(jīng)測序鑒定證明hTERTsiRNA轉錄模板完整、正確插入到pRNAT-H1．1／Neo質粒中，并篩選出一個抑制hTERT表達效率最高的序列，其hTERT表達僅達22．90％．【結論】成功構建并篩選出一個抑制效率最好的靶向hTERT的siRNA表達載體，為以hTERT為靶點的腫瘤基因治療的后續(xù)研究奠定基礎。第二部分：靶向hTERTsiRNA慢病毒表達載體的構建【目的l通過構建靶向人端粒酶催化亞基(hTERT)RNAi慢病毒載體，獲得可供轉染的滴度，為下一步研究該基

5、因缺陷在真核細胞中的影響提供物質基礎。【方法】根據(jù)hTERT設計的兩條互補的單鏈寡核苷酸退火后形成雙鏈插入到pLVTHM質粒，生成合RNAi盒的載體，然后與pCMV-dR8．74和pMD2G病毒包裝所必須的元件經(jīng)脂質體導入T293細胞，包裝成慢病毒，收集上清濃縮病毒并檢測其滴度．RT-PCR檢測干擾后細胞內hTERT表達變化．【結果】將目的序列成功連接到載體上，并經(jīng)測序分析證實載體構建成功；成功包裝成高滴度的慢病毒。RT-PCR和TRAP檢測結果證實構建的hTERT-siRNA慢病毒表達載體可顯著抑制hTERT基因的表達和端粒酶活性?！窘Y論】成功構建了攜帶靶向hTERT基因的RNAi慢病

6、毒載體。該載體能夠有效抑制hTERT的表達和端粒酶活性，為以hTERT為靶點的胺質瘤基因治療的后續(xù)研究奠定基礎。第三部分：慢病毒介導的RNAi技術抑制hTERT表達對U87膠質瘤細胞的作用研究【目的】觀測利用RNAi技術下調hTERT表達對U87人腦膠質瘤細胞的影響。【方法】將慢病毒為載體的靶向hTERTsiRNA構建體—Lt-I感染U87細胞，舍無效序列的慢病毒Lt-non作為空載對照，正常培養(yǎng)U87細胞作為陰性對照．RT-PCR檢測hTERT表達，TRAP法檢測端粒酶表達，MTT和流式細胞檢測分析細胞增殖并口周期變化，熒光原位雜交檢測端粒長度變化，TransweU法分析細胞侵襲力，觀

7、測裸鼠皮下瘤生長．【結果】Lt-I可以明顯下調hTERT的表達，端粒酶活性，細胞侵襲力和裸鼠皮下瘤生長?！窘Y論】靶向hTERT的RNAi基因治療能夠抑制hTERT表達、端粒酶活性和細胞侵襲力，這些效應先于腫瘤細胞的端粒長度明顯縮短前出現(xiàn)，表明hTERT在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可作為膠質瘤基因治療的優(yōu)選靶基因．I關鍵詞】hlmRT；RNA干涉；DNA表達載體；慢病毒屬；基因治療作者：趙鵬導師：傅震教授Studyontheeff