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《短發(fā)夾rna沉默htert 基因抑制裸鼠皮下人腦膠質(zhì)瘤生長的實(shí)驗(yàn)研究論文》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、短發(fā)夾RNA沉默hTERT基因抑制裸鼠皮下人腦膠質(zhì)瘤生長的實(shí)驗(yàn)研究論文孫衛(wèi)東于如同馬衍剛【摘要】目的研究靶向人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）的短發(fā)夾RNA（shRNA）對裸鼠人腦膠質(zhì)瘤中hTERT基因表達(dá)的抑制作用，以及影響腫瘤增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,為腦膠質(zhì)瘤的基因治療探討新的依據(jù)。方法體外培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株，建立人腦膠質(zhì)瘤裸鼠皮下接種模型。將成功造模的36只裸鼠隨機(jī)分為3組（每組12只）。hTERTshRNA組腫瘤體內(nèi)原位注射hTERT質(zhì)粒shRNA（pshRNA）20μg+脂質(zhì)體60μl+PBS；PBS組腫瘤體內(nèi)原位注
2、射PBS150μl；空質(zhì)粒組腫瘤體內(nèi)原位注射空質(zhì)粒20μg+脂質(zhì)體60μl+PBS。觀察腫瘤生長情況。蘇木精-伊紅染色觀察腫瘤組織的病理改變，ethodsHumangliomaU251cells,culturedinvitro,odelsofhumangliomabysubcutaneousinjectionintonudemice.The36mousemodelsformedid(pshRNA)20μg+lipid60μl+PBS;thePBSgroup,giventhatofPBS150μl;theblankplasmidgrou
3、p,giventhatofblankplasmid20μg+lipid60μl+PBS.H-Estainedspecimensofthexenografttumoridtherapy,axiKit大提質(zhì)粒（依其操作手冊工作）。對獲得的質(zhì)粒hTERTpshRNA用DNA分析儀測光密度值（D值）并定量，再做酶切鑒定及測序。RPMI-1640培養(yǎng)基、SiPORTXP-1脂質(zhì)體為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，AnnexinV-FITC試劑盒購自上海晶美公司，hTERT抗體購自SantaCrus公司。1.2細(xì)胞培養(yǎng)U251細(xì)
4、胞根據(jù)GibcoBRL公司的細(xì)胞培養(yǎng)手冊在無菌層流超凈工作臺上完成細(xì)胞培養(yǎng)和傳代后，將U251細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為RPMI-1640，加10%胎牛血清，并加入青霉素、鏈霉素各100mg/L。培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，飽和濕度。倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞處于80%～90%融合階段時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，一般2～3天傳代1次。0.05%胰酶消化，0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗除胰酶，取其中1μl在光鏡下用計數(shù)玻片計數(shù)，調(diào)整比率制成所需細(xì)胞懸液，以備種植。1.3實(shí)驗(yàn)動物分組及裸鼠人腦膠質(zhì)瘤移植瘤模型的制備4～6周齡雄性
5、裸小鼠（BALB/cnude）40只，體重18～22g，購于復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)于SPF級無菌飼養(yǎng)室。收集U251細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞數(shù)約5×106/只（鼠），加入0.3ml無血清無抗生素RPMI-1640培養(yǎng)液中制成細(xì)胞懸液，經(jīng)微量注射器注入裸鼠左側(cè)背部皮下，每2天觀察腫瘤生成情況并用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積。腫瘤體積的計算方法參照公式：體積(mm3)＝a×b2/2，其中a代表腫瘤長徑，而b則代表與a最大徑垂直的寬度值（短徑）。共成功建立皮下腫瘤模型36只，其余4只由于技術(shù)和細(xì)胞狀態(tài)原因或其他原因?qū)е履[瘤未生成而從實(shí)驗(yàn)中剔除。36
6、只腫瘤模型隨機(jī)分成3組，每組12只：PBS對照組（簡稱PBS組，下同），腫瘤體內(nèi)原位注射PBS150μl；脂質(zhì)體包載的空質(zhì)粒組（簡稱空質(zhì)粒組，下同），腫瘤體內(nèi)原位注射空質(zhì)粒20μg+脂質(zhì)體60μl+PBS；hTERTshRNA組，腫瘤體內(nèi)原位注射hTERTpshRNA20μg+脂質(zhì)體60μl+PBS。以上各組給藥液體總量均為150μl。1.4給藥治療方法種植U251細(xì)胞后，待腫瘤增殖至100～150mm3大小，采用腫瘤體內(nèi)原位給藥方法：將皮下腫瘤分為4個象限，藥物分為4份注射，給藥部位波及瘤體周邊反應(yīng)帶處。每72h給藥1次，共5次。1
7、.5動物移植腫瘤取材和腫瘤標(biāo)本切片裸鼠在治療后第5周末斷頸處死，取出腫瘤，測量腫瘤體積，計算抑瘤率，抑瘤率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤體積/PBS對照組平均瘤體積）×100%。將新鮮腫瘤標(biāo)本留作凋亡檢測，余放至液氮保存。標(biāo)本固定后，經(jīng)石蠟包埋切片，采用常規(guī)蘇木精-伊紅染色，在光鏡下觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)、壞死、凋亡等改變。1.6hTERT蛋白的icrosoftExcel及SPSS11.0統(tǒng)計軟件分析，計量數(shù)據(jù)以x±s表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。2結(jié)果2.1hTERTshRNA對裸鼠U251移植瘤增殖
8、的影響裸鼠背部皮下注射U251細(xì)胞后第8～10天出現(xiàn)可觸及且肉眼可見的腫瘤組織。種植U251細(xì)胞約15天后，裸鼠移植瘤增殖至（132.5±16.4）mm3。瘤體內(nèi)原位給藥后，hTERTshRNA組腫瘤增殖明顯比同期PBS
