核盤菌轉(zhuǎn)錄因子ssmads1的表達及其互作蛋白篩選的研究

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1、核盤菌轉(zhuǎn)錄因子SsMADS1的表達及其互作蛋白篩選的研究Researchonexpressionandpartners’analysisoftranscriptionfactorSsMADS1inSclerotiniasclerotiorumon作者姓名：王雪亮專業(yè)名稱：植物病理學指導教師：潘洪玉教授學位類別：農(nóng)學碩士答辯日期：2015年6月1日II中文摘要中文摘要核盤菌轉(zhuǎn)錄因子SsMADS1的表達及其互作蛋白篩選的研究核盤菌(Sclerotiniasclerotiorium(lib.)deBary)是一種隸屬于子囊菌門、盤菌亞門、柔膜菌目

2、、核盤菌科、核盤菌屬的典型同宗配合子囊真菌，其宿主范圍十分廣泛，可危害450多種植物，是一類重要的植物病原真菌，由該菌引發(fā)的植物菌核病，每年都會對我國的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟造成一定的經(jīng)濟損失。因此，核盤菌的相關研究引起植物病理學家的廣泛關注。作為真核生物體內(nèi)重要的一類轉(zhuǎn)錄因子，MADS-box蛋白家族基因廣泛存在于生物體中并參與調(diào)控多種細胞的功能，包括細胞識別、新陳代謝、細胞周期等。實驗室前期研究表明，轉(zhuǎn)錄因子SsMADS1參與核盤菌的生長和毒力的調(diào)節(jié)。為明確SsMADS1及其互作蛋白在核盤菌菌絲的生長和致病力等方面的作用，本研究利用以下幾個方面來建立

3、SsMADS1的作用機理與互作網(wǎng)絡體系研究，通過明確該基因編碼蛋白的亞細胞定位、互作蛋白研究，為深入探討核盤菌的致病機制，有效防治菌核病提供科學依據(jù)。1.SsMADS1原核表達與親和純化。通過反轉(zhuǎn)錄RT-PCR擴增獲得SsMADS1基因的完整開放閱讀框，該基因大小為681bp，共編碼226個氨基酸，分子量為25kDa，理論等電點為6.16。構(gòu)建原核表達載體，經(jīng)IPTG誘導后，使得SsMADS1的融合蛋白在表達宿主菌中大量表達，通過Ni-NTAAgarose親和層析，獲得大量純化的SsMADS1融合蛋白。2.SsMADS1抗血清的制備。以大量

4、純化得到的SsMADS1融合蛋白為抗原，通過實驗動物的自身免疫作用，促使其產(chǎn)生了抗血清，通過瓊脂免疫雙擴散、Western-blot等兩種實驗方法進行特異性免疫檢測，并間接ELISA進行抗血清的效價測定，結(jié)果顯示所得的抗血清與SsMADS1融合蛋白特異性結(jié)合穩(wěn)定效果良好，所獲得大量特異性良好的抗血清為下一步的亞細胞定位和深入研究奠定基礎。3.SsMADS1的亞細胞定位分析。通過生物信息學分析預測該基因定位于細胞核上。利用所制得的抗血清與目的蛋白特異性結(jié)合的特性，分別提取核盤菌總蛋白、核盤菌細胞質(zhì)總蛋白和核盤菌細胞壁總蛋白，利用Western

5、-blot手段檢測，V中文摘要結(jié)果顯示在核盤菌總蛋白、核盤菌細胞質(zhì)總蛋白中均有特異性條帶，核盤菌細胞壁蛋白中沒有特異性條帶，即該基因蛋白主要存在于細胞質(zhì)中。另一方面設計引物并進行特異性PCR擴增得到SsMADS1基因，結(jié)合本實驗室所構(gòu)建的亞細胞定位載體，構(gòu)建目標基因亞細胞定位載體。利用農(nóng)桿菌介導的方法，將構(gòu)建完成的載體轉(zhuǎn)化入煙草中，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察定位信息發(fā)現(xiàn)該基因定位于細胞核上。上述研究結(jié)果表明SsMADS1定位于細胞核上。4.SsMADS1互作蛋白的篩選。利用生物信息學分析Domain互作預測和STRING分析，并結(jié)合His-t

6、agPull-down進行SsMADS1互作蛋白的篩選，通過SDS-PAGE分離和氣質(zhì)聯(lián)動檢測鑒定相結(jié)合的方法，進行SsMADS1互作蛋白的進一步篩選與鑒定。結(jié)果表明SsMADS1主要與蛋白質(zhì)合成酶、絲氨酸合成酶、以及蛋白酶等相互作用。5.酵母雙雜交誘餌載體部分的構(gòu)建。為進一步研究與SsMADS1互作的蛋白，本研究構(gòu)建了SsMADS1的酵母雙雜交誘餌載體部分，通過毒性測定、自激活檢測等方法驗證表明所構(gòu)建的誘餌表達載體無自激活性可以進行下一步實驗。為進一步篩選核盤菌cDNA文庫、解析互作蛋白網(wǎng)絡的驗證提供了基礎。本研究克隆核盤菌重要的一類轉(zhuǎn)錄

7、因子SsMADS1，成功制備了該蛋白的抗血清，預測和篩選了SsMADS1的互作蛋白，構(gòu)建了酵母雙雜交誘餌載體，并進行了亞細胞定位，上述結(jié)果有助于揭示核盤菌生殖發(fā)育機理，為菌核病的防治提供理論依據(jù)。關鍵詞：核盤菌；轉(zhuǎn)錄因子；SsMADS1；亞細胞定位；互作蛋白VIAbstractAbstractResearchonexpressionandpartners’analysisoftranscriptionfactorSsMADS1inSclerotiniasclerotiorumonSclerotiniasclerotiorium(lib.)d

8、eBaryisatypicalhomothallicfungus,belongingtoAscomycota,Pezizomycotina,Helotiales,Scleroti