水貂銅綠假單胞菌分離鑒定及滅活疫苗對水貂生產(chǎn)性能的影響

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1、中文摘要水貂銅綠假單胞菌分離鑒定及滅活疫苗對水貂生產(chǎn)性能的影響水貂出血性肺炎是由銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa，P.a）引起的一種急性、致死性傳染病，主要在夏秋季節(jié)暴發(fā)，各個年齡段的水貂均易感染，發(fā)病率和病死率很高，與水貂病毒性腸炎和水貂犬瘟熱一起成為危害水貂養(yǎng)殖業(yè)的三大傳染病。本實驗從2012年在山東和遼寧地區(qū)暴發(fā)水貂出血性肺炎的疑似病例中，根據(jù)分離株的生長特性、生理生化代謝特點以及分子生物學特征，分離鑒定了22株銅綠假單胞菌毒株。并對分離株進行了DNA隨機多態(tài)性分析和藥敏試驗，分析了分離株之間的親緣

2、關系以及分離株對當前常用治療藥物的敏感性情況。銅綠假單胞菌外膜蛋白F（OprF）在不同血清型的毒株之間高度保守，而且具有很好的免疫原性，是保護性抗原。因此，本研究從患出血性肺炎的病死水貂中分離鑒定得到的銅綠假單胞菌中，通過PCR擴增出OprF基因片段，將該基因克隆到pMD18-T載體進行了測序。將測序正確的目的基因連接到表達載體pET-28a后轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21中，通過IPTG誘導、超聲裂解、鎳柱純化、SDS-PAGE電泳分析和Western-blot鑒定得到了大量表達的外膜蛋白OprF，為下一步間接ELISA方法的建立打下

3、了基礎。利用純化的蛋白OprF，對建立間接ELISA方法的條件進行了篩選，確定了間接ELISA外膜蛋白OprF的最佳包被濃度為2μg/mL和血清的最佳稀釋倍數(shù)為1:4，其他與常規(guī)條件相同。篩選出該ELISA檢測方法的陽性臨界值為0.06，最低檢出量為1:256，組內(nèi)重復性試驗變異系數(shù)在0.33%～8.27%，組間重復性試驗變異系數(shù)在1.24%～5.59%，均小于10%，表明該方法具有良好的重復穩(wěn)定性。建立的ELISA檢測方法具有良好的特異性，對本實驗保存的其他病原體陽性血清：水貂大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和肺炎克雷伯菌均

4、為陰性。用已經(jīng)建立的間接ELISA方法檢測已知的30份陽性血清，28份為陽性，符合率為93.3%。該方法可以準確的評價出水貂體內(nèi)各種銅綠假單胞菌血清型的抗體水平，具有應用價值。II本研究從選用銅綠假單胞菌的當前主要流行血清型G、B型和肺炎克雷伯菌K1型3種菌株制備成滅活疫苗。免疫了以10%滅活肺炎克雷伯菌為佐劑的疫苗，保護率為83%；免疫了以10%Al(OH)3佐劑的疫苗，保護率為71%；而作為空白對照組，僅注射了生理鹽水的第6組小鼠的存活率為33%。相對于傳統(tǒng)的Al(OH)3佐劑，肺炎克雷伯菌本身可以作為疫苗成分，保護機體免于

5、該病原菌的感染，同時又兼有良好的免疫調(diào)節(jié)活性，加強了機體對銅綠假單胞菌的免疫應答，產(chǎn)生了更高的抗體水平和提供了更好的免疫保護，獸醫(yī)臨床具有一定的應用價值。關鍵詞：水貂，出血性肺炎，銅綠假單胞菌，肺炎克雷伯菌，滅活疫苗IIIAbstractIsolationandidentificationofminkPseudomonasaeruginosaandstudyoftheinfluenceofinactivatedvaccineonproductionperformanceofminkMinkhemorrhagicpneumonia

6、iscausedbyPseudomonasaeruginosaandmainlyoccursinsummerandautumn.Thiskindofdiseaseisacuteandfatalformink.Minkforallagesishighlysensitivetothisdiseasewhichhasahighmorbidityandlethality.Ithasbecomeoneofthemostseriousdiseaseslikeminkparvoviralenteritisandminkdistemperwhi

7、charethehugeobstaclesfortheminkfarmingindustry.ThisstudyisolatedsomeP.aeruginosastrainsfromdeadminkswhichweresuspectedofbeinginfectedwithhemorrhagicpneumoniainShandongandLiaoningin2012.Weidentified22P.aeruginosastrainsaccordingtothegrowthphenotypes,biochemicalcharact

8、erizationsandcharacteristicsofthemolecularbiologyofthebacteria.BasedontherandomamplifiedpolymorphicofDNAandantimicrobialsusceptibil