禽致病性大腸桿菌phopq基因缺失對其致病性的影響

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1、分類號．０３６４：民３７８２＋１單位代碼：１密級：學(xué)號：１２７２０２３３會傲４犬＃學(xué)位論文禽致病性大腸桿菌基因缺失對其致?。崳娦缘挠绊懀崳姡裕瑁澹牐澹妫妫澹悖簦牐铮妫牷叮墸恚酰簦幔睿簦牐铮睿牷澹峄铮澹睿椋悖耄铮妫牐粒觯椋幔睿崳姡牐穑纾牐幔簦瑁铮澹睿椋悖牐牛螅悖瑁澹颍椋悖瑁椋幔牐悖铮欤椋崳姡穑缪校牼浚犐坏俨┭裕墸墸崳娭笇?dǎo)教師：祁巧宗教授申請學(xué)位口類級別：農(nóng)學(xué)碩女專業(yè)名稱：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研％方向：動物疫病病理與生物防治所

2、在學(xué)院；動物科技舉院答辯委員會主席；二零一五年六月AnhuiAgriculturalUniversityMasterDissertationTheeffectofthephoP/QmutantonthepathogenicityofAvianpathogenicEscherichiacoliCandudate:HuangBo-yanSupervisor:Professor.QIKe-zongAcademicDegreeappliedfor:MasterofAgricultur

3、eMajor:BasicVeterinaryScienceDirection:AnimalPathologyandBiologicalControlCollege:AcademyofAnimalScienceandTechnologyJune2015國家自然科學(xué)基金資助項目《PhoP/Q對APEC關(guān)鍵毒力因子及β-防御素抗感染的調(diào)控研究》項目編號31372402摘要禽致病性大腸桿菌（AvianPathogenicEscherichiacoli,APEC）是嚴重危害禽類健康和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要病原菌

4、。而PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)是一種廣泛存在于禽致病性大腸桿菌中調(diào)控細菌毒力和許多細胞活性的信號傳導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)，有關(guān)研究表明APEC致病過程中PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)在調(diào)控細菌致病力方面發(fā)揮著重要作用。但目前關(guān)于禽致病性大腸桿菌中PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)控的靶基因位點未見詳細報道。本研究通過構(gòu)建禽致病性大腸桿菌的phoP和phoQ基因缺失株和回復(fù)株，從野生株和基因缺失株之間毒力因子的轉(zhuǎn)錄水平、對細胞和雞體致病力的比較，了解PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)與APEC致病力之間的關(guān)系。為后續(xù)明確PhoP/Q

5、二元調(diào)控系統(tǒng)對APEC毒力的調(diào)控機制奠定一些研究基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下：1、禽致病性大腸桿菌phoP/Q基因缺失株及回復(fù)株的構(gòu)建為探討禽致病性大腸桿菌的PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)對細菌的調(diào)控作用，本實驗通過從臨床分離的29株禽致病性大腸桿菌中篩選出含有phoP基因和phoQ基因并對氯霉素和氨芐青霉素敏感的菌株，最終篩選出一株目的菌株AE17。采用Red同源重組的方法對目的菌株的phoP基因和phoQ基因內(nèi)部功能區(qū)進行基因缺失，成功構(gòu)建兩株單基因缺失株（AE18和AE19）和一株雙基因缺失株（

6、AE20）。對三株基因缺失株使用低拷貝質(zhì)粒PSTV-28進行基因回復(fù)，根據(jù)生物信息學(xué)軟件分析和相關(guān)文獻顯示phoP基因和phoQ基因共用一個啟動子，所以phoQ缺失株和雙基因缺失株構(gòu)建相同的基因回復(fù)片段。將含有啟動子的基因回復(fù)片段酶切回收后連接到已經(jīng)酶切的低拷貝質(zhì)粒PSTV-28上，回收構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入相應(yīng)的基因缺失株內(nèi)，成功構(gòu)建基因回復(fù)菌株CAE18、CAE19和CAE20。2、phoP/Q基因缺失對APEC生物學(xué)特性及毒力的影響比較構(gòu)建成功的基因缺失株和基因回復(fù)株與野生株毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平和

7、生化特性的變化。本實驗通過生長曲線的測定、生化發(fā)酵實驗、運動性能力的檢測和Real-timePCR檢測毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平四方面探索PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)的基因缺失對APEC生長特性和毒力的影響。生長曲線測定結(jié)果顯示，基因缺失株和回復(fù)株在LB液體培養(yǎng)基中的生長性能較野生株未發(fā)生明顯改變。生化發(fā)酵實驗鑒定結(jié)果顯示缺失株和回復(fù)株的11種腸桿菌科生化特性與野生株結(jié)果一致，表明基因的缺失對APEC生化特性不會造成影響。運動性能力的檢測結(jié)果表明phoP和phoQ基因的缺失能顯著降低AE17的運動性能力。R

8、eal-timePCR結(jié)果顯示，禽致病性大腸桿菌基因缺失株較野生株中MarA、metJ、ibeA、sodA、iss、ompA和fimC等13個毒力基因轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)或下調(diào)。I3、phoP/Q基因缺失對細胞和雞體致病力的影響Real-timePCR結(jié)果顯示PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)可以調(diào)控APEC中毒力因子的轉(zhuǎn)錄和表達，影響細菌的致病力。本實驗通過對CEF細胞黏附和入侵能力的比較、LD50的測定和動物病理組織切片的觀察三方面探索了PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)對APEC致病力的影響。對雞胚成纖