禽致病性大腸桿菌phopq蛋白的表達(dá)純化及其毒力調(diào)控分析

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1、．巧類與啤化代料：１０３６４：＇密級(jí)巧：１巧２０２２８；學(xué)學(xué)位論文禽致病性大腸桿菌ＰｈｏＰ／Ｑ蛋白的表達(dá)純化及其毒力調(diào)控分析Ｅｘｒｅｓｓｉｏｎｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐ，ｐＰｈｏＰ／ｒｏｔｅｉｎｓｏｎａｖｉａｎａｔｈｏｅｎｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｃｏｌｉＱｐｐｇ：王曼研究生指導(dǎo)教師；祁甫宗教授申請(qǐng)學(xué)位口類綴別；農(nóng)學(xué)碩±．．醫(yī)學(xué)專業(yè)名稱；基礎(chǔ)獸動(dòng)物

2、病理與生物防治研究方向：所在學(xué)院：動(dòng)物科技學(xué)院笞辯委員會(huì)主席：＿２０１５年６月獨(dú)創(chuàng)性聲明１；本人聲明所巧么的論義是我個(gè)人化計(jì)師巧＾Ｋ進(jìn)的研巧；化妓取得的研究成化。盡巧，所化，除ｆ義中特別加Ｗ標(biāo)注和城謝的化知外論義中小包存巧他、ｄ巧發(fā)表或撰過的巧町化川過的材料。我究成張，化小包含為巧得女徽化化大芋或其它教行機(jī)構(gòu)的學(xué)化或證向一。同Ｉ；作的問志對(duì)本研巧所做的任何扣獻(xiàn)均ｄ化論義中化了Ｗ視的說＾化衣?。x總；：研究牛．鞭名時(shí)１川；興＿的ｇｕ＿＿／的關(guān)于論文使用授

3、權(quán)的說明，：本人巧午、即學(xué)校軒權(quán)保留送文胳：７郵安徽農(nóng)化大學(xué)有關(guān)保留化用學(xué)化論義影的規(guī)忠匯義的結(jié)印件和磁盤，允許論義被爸閱和借閒，可兇采用印、±縮印或掃描等貸制ｒ段佔(zhàn)存、或編學(xué)化論義。同思安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可用不問方乂化小同媒體發(fā)巧、化捕學(xué)化論義的全部部分內(nèi)稗。文（保密的學(xué)位論在解密后應(yīng)遵守此棲議）研化Ｉ：．豁名：心參—時(shí)間：＞眨巧戶ｊ容１」巧－削｜｜１撰名：時(shí)問；皮年（＜〇］ＳｉＩAnhuiAgriculturalUniversityMasterDissertationE

4、xpression,purificationandvirulenceregulationanalysisofPhoP/QproteinsonavianpathogenicEscherichcoliAnswerer:WangManAdvisorProfessor:QiKe-zongAcademicDegree:MasterofAgricultureMajor:BasicVeterinaryScienceDirection:AnimalPathologyandBiologicalPreventionInstitut

5、e:AcademyofAnimalScienceandTechnologyJune2015國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目：(31372402)《PhoP/Q對(duì)APEC關(guān)鍵毒力因子及β-防御素抗感染的調(diào)控研究》摘要禽致病性大腸桿菌(AvianPathogenicEscherichiacoli,APEC)能引起禽類高死亡率給養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展帶來重大危害。存在于APEC中的PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)是由菌體外膜蛋白PhoQ感應(yīng)外界環(huán)境變化，繼而將信號(hào)傳遞給PhoP，PhoP能夠調(diào)控病原菌毒力基因表達(dá)，這對(duì)菌體侵襲機(jī)體上皮細(xì)胞導(dǎo)致機(jī)體

6、致病起著關(guān)鍵作用。探索PhoQ介導(dǎo)PhoP調(diào)控的APEC毒力基因靶點(diǎn)，針對(duì)APEC檢測受PhoP調(diào)控的外膜蛋白、內(nèi)毒素等毒力相關(guān)基因，為后續(xù)進(jìn)一步明確PhoP/Q調(diào)控系統(tǒng)對(duì)APEC毒力的影響奠定了基礎(chǔ)。為探討由PhoQ介導(dǎo)的PhoP對(duì)毒力基因的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)從基因調(diào)控角度入手通過禽致病性大腸桿菌phoP/Q基因的原核表達(dá)獲得其蛋白產(chǎn)物，檢測受PhoP蛋白調(diào)控的毒力相關(guān)基因；同時(shí)，得到了PhoQ蛋白為實(shí)驗(yàn)室對(duì)PhoQ的研究提供了材料。本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)進(jìn)一步研究PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)對(duì)禽致病性大腸桿菌毒力的調(diào)控功能

7、和作用機(jī)理提供一些參考。具體內(nèi)容和結(jié)果如下：1禽致病性大腸桿菌PhoP/Q蛋白的表達(dá)根據(jù)NCBI中報(bào)道的APECphoP/Q基因編碼區(qū)序列(GenBank登錄號(hào)CP000468.1)，分別設(shè)計(jì)phoP(5′、3′端分別添加EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn))和phoQ引物(5′、3′端分別添加EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)，本文中所提PhoQ均為膜外區(qū))用于擴(kuò)增phoP/Q基因片段，將得到的phoP/Q基因片段克隆到PMD19-T載體上，經(jīng)酶切和測序驗(yàn)證后分別將PMD19-T-phoP/Q和pET32a進(jìn)行雙酶切

8、連接，成功構(gòu)建pET32a-phoP/Q原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。將測序正確的E.coliBL21(DE3)-pET32a-phoP/Q接種于LB液體培養(yǎng)基，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)PhoP/Q重組蛋白，SDS-PAGE檢測分子量分別為42.9KDa和34.43KDa，與其理論分子量相一致。2禽致病性大腸桿菌PhoP/Q蛋白的純化及鑒定工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)重組的Ph