鐵攝取相關(guān)調(diào)控基因rstA與fur對禽病原性大腸桿菌和尿道致病性大腸桿菌毒力的影響.pdf

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1、鐵攝取相關(guān)調(diào)控基因rstA與扣，對禽病原性大腸桿菌和尿道致病性大腸桿菌毒力的影響Rolesofironacquisition—relatedregulationgenesrstAand砌，invirulenca“APECandUPECnceoI，跖，ArE本文受國家自然科學基金(31272559，30972196，30771604，30471281)；長江學者與創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(PCSIRT0978)和江蘇省高校優(yōu)勢學科建設(shè)項目(PAPD)資助研究生：葉正琴專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學導師：高崧教授揚州大學獸醫(yī)學院2014年6月葉正琴：鐵攝取相關(guān)調(diào)控基因rst．4與fur對APE

2、C和UPEC毒力的影響一1鐵攝取相關(guān)調(diào)控基因rstA與．肛，對禽病原性大腸桿菌和尿道致病性大腸桿菌毒力的影響善究嘉；芝芝萋授刪321導師：高崧教授。V264u摘要埃希氏大腸桿菌(Escher&hiacoli，E．coli)，俗稱大腸桿菌，在恒溫動物出生后數(shù)小時即可進入消化道后段定居繁殖，繼而成為腸道內(nèi)正常菌群。在特定環(huán)境中部分大腸桿菌可成為致病性大腸桿菌，主要經(jīng)由腸道內(nèi)和腸道外引起感染現(xiàn)象。禽致病性大腸桿菌(AvianpathogenicE．coli,APEC)和人的尿道病原性大腸桿菌(UropathogenicE．coli，UPEC)均屬于腸道外致病性大腸桿菌。AP

3、EC可引起全身或局部的感染，該菌主要感染禽類；UPEC則可引起人的尿道感染。有研究表明這兩種菌株存在部分相似的毒力因子，其中包括鐵攝取系統(tǒng)，有人推斷APEC和UPEC之間可能存在著非常密切的同源性關(guān)系，尚待進一步的細菌常利用雙組份信號傳導系統(tǒng)(Two—componentregulatorysystem，TCS)對外界刺激產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)以增強對環(huán)境的適應(yīng)能力，而RstA／RstB系統(tǒng)正是一種由外膜感受蛋白RstB與其相應(yīng)的應(yīng)答蛋白RstA所組成的雙組份系統(tǒng)。其中rstA基因編碼的RstA蛋白可參與鐵攝取途徑的調(diào)控。Fur(ferricacquisitionregulato

4、r)蛋白在鐵攝取系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要作用，研究表明該蛋白是一種負調(diào)控蛋白，可使細菌避免由于攝鐵過量而產(chǎn)生“鐵中毒”的現(xiàn)象，對于維持細胞內(nèi)鐵離子濃度的平衡具有重要作用。由此可見，RstA和Fur均在鐵攝取途徑中有著重要的調(diào)控作用。本研究以本室自行分離的APEC強毒株E058和UPEC強毒株U17為模式菌株，利用九Red同源重組技術(shù)，分別構(gòu)建了舡r和rstA的單基因突變株E058Afur、E058ArsM、U17Afur、U17ArstA以及雙基因缺失株E058AfurArsM和U17AfurArstA。同時將目的基因連同其自身啟動子克隆至pMD一18SimpleT載體上，

5、通過電轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到基因缺失株中篩選獲得回復株。通過對突變株生物學特性的研究以及對動物致病性的評價來研究鐵攝取調(diào)控基[]fur和rstA對APECE058和UPECU17致病性的影響，進而比較兩者毒力因子的相似性，為進一步研究人的尿道感染(Urinarytractinfections，UTIs)以及禽大腸桿菌病的致病機制和防治措施提供依據(jù)。體外進行的各項試驗結(jié)果顯示，突變株與野生株相比并沒有出現(xiàn)太大的差異，如生長2揚州I大學碩士學位論文曲線測定顯示，在貧鐵培養(yǎng)基中的生長情況與野生株無異，而在富鐵環(huán)境中加，．缺失株的生長速度明顯下降，RstA缺失后也對細菌的

6、生長速度有一定的影響但并不顯著；血清殺菌試驗結(jié)果顯示，突變株與野生株在抗血清補體殺菌能力方面并沒有明顯差異；在巨噬細胞吞噬試驗中，突變株與野生株相比在抗吞噬和胞內(nèi)存活方面也沒有出現(xiàn)太大差異，暗示其它毒力代償機制可能發(fā)揮著作用。1日齡雞致死性試驗結(jié)果顯示，rstA突變株毒力明顯下降，而mr突變株毒力致弱不明顯。35日齡SPF雞動態(tài)分布試驗結(jié)果顯示，E058ArstA和U17hrstA的致病作用相對于野生株有明顯的下降，在所有臟器中定植能力均表現(xiàn)顯著下降，而E058Afur和U17Afur未見明顯致弱；雙基因缺失株E058AfurArstA和U17AfurArstA毒力較

7、單基因缺失株下降更為顯著，表明危，．與rstA之間存在協(xié)同致病的作用。組織病理學研究表明，野生株在雞的臟器中所造成的病變較rstA單基因缺失株和雙基因缺失株更加明顯，而加缺失株感染雞的臟器病變程度與野生株相似。ArstA單突變株與AfurArstA雙突變株致病力明顯F降，而Afur單突變株致病力則沒有明顯變化。上述結(jié)果表明，參與鐵攝取調(diào)控的雙組份系統(tǒng)RstA／RstB中rstA基因與APEC和UPEC的致病力有較強的相關(guān)性，而介導鐵攝取負調(diào)控作用的加r基因并不能獨立地對其致病性產(chǎn)生顯著的影響，但可能與rstA基因發(fā)揮協(xié)同致病的作用。突變株與親本株在其