stat1a基因crispr敲除對斑馬魚早期胚胎骨骼發(fā)育的影響研究

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1、碩士學位論文stat1a基因CRISPR敲除對斑馬魚早期胚胎骨骼發(fā)育的影響研究學科專業(yè)生理學學位類型?科學學位□專業(yè)學位研究生姓名熊玖玲導師姓名、職稱陳湘定教授論文編號湖南師范大學學位評定委員會辦公室二零一五年五月分類號密級學校代碼10542學號201202141154stat1a基因CRISPR敲除對斑馬魚早期胚胎骨骼發(fā)育的影響研究TheeffectsstudiesofCRISPRknockoutforstat1ageneonzebrafishembryonicskeletaldevelopment研究生姓名熊玖玲指導教師姓名、職稱陳湘定教授學科專業(yè)生理學研究方向生理基因組學與

2、生物信息學湖南師范大學學位評定委員會辦公室二零一五年五年湖南師范大學學位論文原創(chuàng)性聲明：所呈交的學位論文，獨本人鄭重聲明，是本人在導師的指導下立進行研究工作所取得的成果。除文中己經(jīng)注明引用的巧容外，本論文不含任何其他個人或集體巴經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作度成果．対本文巧研究做出重要貢獻的個人和集體，均邑在文中ＬＸ明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔。－學位論文作者簽違：？〇化年ｔ月曰；多湖南師范大學學位論文版權(quán)使用授權(quán)書、使用學位論文的規(guī)定本學位論文作者完全了解學棱有關保留，研究生在校攻讀學位期間論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬湖南師范大學

3、。同意學校保留并向固家有關部口或機構(gòu)送交論文巧復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)湖南師范大學可Ｗ將本學位論文巧全部或都分巧容編入有關數(shù)據(jù)庫進行拾蒙，可ｔ義采用影巧、鑑巧或擔描等復制手段保存和匯編本學位論文。作者簽名：Ｂｍ：ｂｎ＾Ｂ導師簽名：下日期知６月？掃摘要骨質(zhì)疏松表現(xiàn)為較低的骨密度，是一種容易導致骨折的全身性骨骼疾病，嚴重影響公眾健康，與骨骼發(fā)育有密切關系。本研究室早期通過基因差異表達譜分析和基因組關聯(lián)分析等，發(fā)現(xiàn)STAT1基因與骨質(zhì)疏松密切相關，但不清楚STAT1基因在體調(diào)控骨骼發(fā)育而導致骨表型改變的作用機制，所以本研究結(jié)合分

4、子遺傳學手段，選擇斑馬魚模型進行在體研究，進一步揭示骨骼發(fā)育的分子調(diào)控機制，對骨質(zhì)疏松癥的預防、診斷、治療以及藥物開發(fā)都有重要意義。斑馬魚與人類在骨骼發(fā)育過程中的基因、信號通路有高度同源性，且STAT1基因進化上較為保守，人類STAT1基因的兩個不同剪接體STAT1-alpha和STAT1-beta對應于斑馬魚兩個不同基因stat1a和stat1b，研究發(fā)現(xiàn)stat1a在斑馬魚胚胎早期表達量特別高。而且，與其他動物模型相比，斑馬魚個體小、幼魚通體透明，利于骨骼發(fā)育的觀察。本文主要通過CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)，在斑馬魚stat1a基因上設計合適的打靶位點，將體外合成的特異

5、性sgRNA（終濃度20ng/μL）和Cas9-mRNA（終濃度300ng/μL）顯微共注射進斑馬魚一細胞內(nèi)，并通過活性檢測證實了所選位點的有效性。對F0代斑馬魚提取基因組DNA后進行T7E1酶切檢測以及Sanger測序，成功篩選到2條stat1a基因突變的F0代斑馬魚。在F1代受精后20天、30天和47天，隨機挑取兩個突變體的F1代斑馬魚和野生型斑馬魚各10條，測量其長度，發(fā)現(xiàn)突變體F1代斑馬魚要比野生型生長速度更快。I結(jié)果與小鼠stat1-/-敲除研究發(fā)現(xiàn)骨密度與骨量增加一致，提示stat1可能通過抑制成骨細胞生成影響骨骼發(fā)育。目前，已經(jīng)從F2代胚胎中鑒定到stat1a突變體

6、純合子。用Phyre軟件預測F1代突變體STAT1蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，其二級結(jié)構(gòu)的某些保守結(jié)構(gòu)域位點發(fā)生改變。STAT1蛋白的V638和S639處是同源二聚體界面，對應于F1代突變體的這兩個氨基酸位點，V630和S631卻不再是同源二聚體接觸面?？赡苁怯捎趕tat1a基因突變影響STAT1同源二聚體的結(jié)合，影響骨骼的生長發(fā)育，從而導致斑馬魚生長更快。為進一步分析stat1a基因敲除后的變化，利用不同濃度STAT1抑制劑磷酸氟達拉濱（Fludarabine）處理斑馬魚胚胎10天，發(fā)現(xiàn)隨濃度增加死亡率也隨之增加。低于5μg/mL濃度組的死亡率低于10%，10μg/mL、20μg/m

7、L以及40μg/mL濃度組死亡率達到30%-40%，而50μg/mL濃度組從處理第5天開始，死亡率接近70%。從處理第3天開始，實驗組斑馬魚陸續(xù)出現(xiàn)輕微或嚴重畸形，且隨處理濃度增大，畸形魚的死亡率增加，且死亡的斑馬魚絕大部分是畸形魚。氟達拉濱可抑制STAT1表達，而STAT1抑制成骨細胞分化，出現(xiàn)畸形可能是由于STAT1的抑制引起破骨細胞、成骨細胞生理功能失衡而導致骨骼發(fā)育異常，最終產(chǎn)生骨表型的改變。關鍵詞：stat1a，CRISPR/Cas9，骨骼，斑馬魚IIABSTRACTC