利用酪蛋白激酶ⅰδ磷酸化修飾半乳糖凝集素-3

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1、碩士學(xué)位論文tionofGalectin>3byCasein指導(dǎo)教師:臺桂花教授?級T科：生物學(xué)_.芬愈免科:生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究方向：糖生物學(xué)'.>、分位類型：學(xué)術(shù)碩士獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨立進(jìn)行研究工作所取得的成果。據(jù)我所知，除了特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。對本人的研究做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中作了明確的說明。本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：円期:乂/('〇/廠/又學(xué)位論文使用授權(quán)書本學(xué)位論文作

2、者完全了解東北師范大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：東北師范大學(xué)有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交學(xué)位論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)東北師范大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存、匯編本學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書）學(xué)位論文作者簽名：、臨巧指導(dǎo)教師簽名：km)円期：r2^y1〇ti7>日期：>學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位：________________________________電話:通訊地址：___

3、_____________________________郵編:摘要半乳糖凝集素-3（Galectin-3）是半乳糖凝集素家族中唯一的嵌合型蛋白，其分子量約為31kDa。作為一種腫瘤相關(guān)蛋白，Galectin-3在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，與細(xì)胞生長、粘附、凋亡以及血管生成、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。酪蛋白激酶I（CaseinKinaseI）是絲氨酸/蘇氨酸選擇性蛋白激酶，共有7個亞型（α，β，γ1，γ2，γ3，ε，δ），分子量為22到55kDa，等電點大于9。多分布于真核細(xì)胞中的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和

4、紡錘體中。CaseinKinaseI有重要的生理功能，它參與很多生理生化過程，如生命節(jié)律、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA修復(fù)和DNA翻譯等。文獻(xiàn)報道，Galectin-3能被CaseinKinaseIδ磷酸化，細(xì)胞內(nèi)30%Galectin-3以磷酸化的形式存在，但磷酸化的Galectin-3的功能卻不清楚。為此，本論文作為研究磷酸化Galectin-3功能的前期工作，探索了CaseinKinaseIδ磷酸化Galectin-3的生化反應(yīng)條件，檢測方法以及磷酸化位點，為大量制備磷酸化的Galectin-3和深入研究其功能

5、奠定基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容和成果如下：首先，構(gòu)建CaseinKinaseIδ表達(dá)載體，并表達(dá)純化CaseinKinaseIδ蛋白。主要過程包括：從人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116中提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)NCBIGeneBank收錄的CaseinKinaseIδ序列設(shè)計引物，以cDNA為模板，擴增出CaseinKinaseIδ的目的基因序列。經(jīng)過測序結(jié)果比對，確認(rèn)目的基因序列正確。對目的基因與載體進(jìn)行酶切、連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建了pET28aCaseinKinaseIδ表達(dá)質(zhì)粒。用Ni-NTA親和柱提取

6、和純化目的蛋白。經(jīng)過SDS-PAGE檢測，獲得的目的蛋白為CaseinKinaseIδ蛋白。然后，建立兩種檢測CaseinKinaseIδ催化Galectin-3磷酸化的方法。通過HPLC對Galectin-3磷酸化反應(yīng)體系中ATP消耗情況進(jìn)行檢測，我們發(fā)現(xiàn)CaseinKinaseIδ能夠?qū)alectin-3磷酸化，反應(yīng)消耗了ATP；通過Native-PAGE與Westernblot對Galectin-3磷酸化反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測，我們發(fā)現(xiàn)在磷酸化反應(yīng)后有被Galectin-3特異性抗體所識別的磷酸化條帶產(chǎn)生。

7、基于以上實驗結(jié)果，我們認(rèn)為這兩種檢測方法都可以用來檢測由CaseinKinaseIδ催化的Galectin-3磷酸化反應(yīng)。此外，我們對磷酸化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)固定底物Galectin-3的量為25μg，ATP為200μM時，優(yōu)化得到了反應(yīng)條件，即CaseinKinaseIδ的量為0.375μg，反應(yīng)溫度為20oC，反應(yīng)時間為10min。最后，對Galectin-3的磷酸化位點進(jìn)行探究?？紤]到CaseinKinaseIδ為絲氨酸選擇性蛋白激酶，我們設(shè)計引物將Galectin-3的絲氨酸（6位、12位、96位

8、和188位）定點突變?yōu)楸彼?。?jīng)電泳驗證、測序比對，我們得到了僅有目標(biāo)位點發(fā)生突變的4種突變體質(zhì)粒。之后，我們誘導(dǎo)突變體蛋白表達(dá)，并用Lactose-SepharoseCL6B凝膠柱對突變體蛋白進(jìn)行分離純化。通過對比突變型與野生型Galectin-3的磷酸化反應(yīng)情況，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)6位的絲氨酸發(fā)生突變時，磷酸化條帶消失，磷酸化反應(yīng)不能發(fā)生。據(jù)此我們得出III結(jié)論：由CaseinKinaseIδ催化的Ga