豬偽狂犬病野毒感染與疫苗免疫鑒別診斷方法的建立及初步臨床應用

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1、豬偽狂犬病野毒感染與疫苗免疫鑒別診斷方法的建立及初步臨床應用DevelopmentandInitialApplicationofanImmunoassayfortheDiscriminationbetweenPRV-infectedandVaccinatedAnimals作者姓名：王寅彪專業(yè)名稱：預防獸醫(yī)學研究方向：病原微生物與分子免疫學指導教師：張改平教授學位類別：農(nóng)學博士培養(yǎng)單位：吉林大學動物醫(yī)學學院論文答辯日期：2015年06月06日授予學位日期：年月日論文評閱人：答辯委員會組成：姓名職稱工作單位姓名職稱工作單位羅滿林教授華南農(nóng)業(yè)大學主席王笑梅研究員中國農(nóng)業(yè)科

2、學院方六榮教授華中農(nóng)業(yè)大學委員涂長春研究員軍事醫(yī)學科學院姜平教授南京農(nóng)業(yè)大學丁壯教授吉林大學張彥明教授西北農(nóng)業(yè)科技大學錢愛東教授吉林農(nóng)業(yè)大學徐鑌蕊教授中國農(nóng)業(yè)大學歐陽紅生教授吉林大學王春鳳教授吉林農(nóng)業(yè)大學張乃生教授吉林大學本研究受國家自然科學基金(No.31172348)、國家生豬產(chǎn)業(yè)技術體系（No.CARS36-36）及河南省生豬產(chǎn)業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊（No.S2012-06）的資助，在此表示感謝！ThisworkwassupportedbyNationalNaturalScienceFoundation(No.31172348),ChinaAgricultureR

3、esearchSystem(No.CARS-36),andthePigIndustryTechnologySystemInnovationTeamProjectofHenanProvince(No.S2012-06).中文摘要豬偽狂犬病野毒感染與疫苗免疫鑒別診斷方法的建立及初步臨床應用偽狂犬?。≒R）是多種動物共患的傳染病；其病原體偽狂犬病病毒（PRV）是一種豬的皰疹病毒，分類學命名為豬皰疹病毒I型（Suidherpesvirus1）。豬是PRV的傳染源和自然貯存宿主，感染后表現(xiàn)為發(fā)熱、仔豬神經(jīng)癥狀和高死亡率、大中豬出現(xiàn)呼吸道癥狀等臨床特征。消化道、呼吸道、精液、胎

4、盤及空氣等是PRV的主要傳播途徑。PRV對于口鼻部呼吸道的上皮細胞具有非常強的嗜性；其基因組是大小約為150kb的線性雙鏈DNA，編碼70-100余種蛋白。2011年底，在河北、河南、山東、山西等多個省份許多使用Bartha-K61疫苗免疫豬場爆發(fā)了疑似PR的疫病，發(fā)病豬出現(xiàn)高溫(40-42°C）、食欲不振、咳嗽、腹瀉并伴隨有系統(tǒng)性神經(jīng)癥狀，新生仔豬死亡率高；病毒分離等實驗證實引起這場疫病爆發(fā)的源頭是變異的PRV病毒，這對PR的防控提出了嚴峻挑戰(zhàn)。因此本研究對河南省及周邊部分省份PRV的流行進行了血清學調查和分子進化分析；表達了PRV新流行毒株的gE蛋白和gB蛋白并

5、制備了單抗，以期建立的PRV抗原抗體ELISA檢測方法和制備的膠體金快速檢測試紙能在PRV鑒別診斷和免疫抗體水平評價等方面發(fā)揮作用。血清流行病學分析結果表明河南省PRVgE抗體陽性率在2012年升高至38.0%，2013年仍居高不下（31.3%）。種豬群陽性率為36.3%，育肥后期（19-25周齡）陽性率高達59.3%，后備種豬陽性率為23.8%。在2013年檢測的347個豬場中，豬場陽性率為83.6%，其中豫北豬場陽性率最高為93.8%。這些數(shù)據(jù)表明PR在河南省呈嚴重流行態(tài)勢?；诜蛛x的12株PRV新流行株的gE、gB和gC基因開展的分子進化分析顯示新流行株處于獨

6、立的進化分支，與國內(nèi)早期PRV分離株和其它新流行株進化關系較近，與Bartha疫苗株進化關系較遠。為建立針對PRV新流行毒株抗體檢測的ELISA方法，我們表達了PRV新流行株（湯陰株）的gE蛋白和gB蛋白。其中gE蛋白為可溶表達，gB蛋白為包涵體表達；利用Ni-NTA親和層析和離子交換純化的gE蛋白和gB蛋白分別建立了gE抗體檢測的間接ELISA（gE-ELISA）和gB抗體檢測的間接ELISA（gB-ELISA）方法。gE-ELISA與商品化試劑盒gpI-ELISA（IDEXX）的符合率I為88.76%；特異性（DSP）為79.15%；敏感性（DSN）為94.03

7、%。gB-ELISA與商品化試劑盒gB-ELISA（IDEXX）的符合率為93.14%；DSP為77.78%；DSN為93.64%。在檢測的66個陽性場中，陽性活躍場占95.5%，陽性穩(wěn)定場占4.5%。在PRVgE抗體陰性樣品中，gB抗體陽性率占到了94.9%。制備了針對gE蛋白和gB蛋白上具有免疫優(yōu)勢的表位的單抗并建立了單抗阻斷ELISA檢測方法。gE單抗阻斷ELISA（blockinggE-ELISA）與商品化試劑盒gpI-ELISA的符合率為94.10%；DSP為89.90%；DSN為96.18%。gB單抗阻斷ELISA（blockinggB-ELISA）