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《鑒別鹿結(jié)核病野毒感染與卡介苗免疫間接elisa方法的建立及初步驗證》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、分類號：S858.92單位代碼：10193密級：無學號：2012624碩士學位論文鑒別鹿結(jié)核病野毒感染與卡介苗免疫間接ELISA方法的建立及初步驗證EstablishmentandPrimaryVerificationofIndirectELISADetectionforDeerTuberculosistoIdentifytheWildInfectionandBCGImmunization作者姓名：劉楊學位類別：農(nóng)學碩士專業(yè)名稱：預防獸醫(yī)學研究方向：經(jīng)濟動物疫病學指導教師：杜銳教授所在學院：動物
2、科學技術(shù)學院2015年5月獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學位論文是本人在導師指導下，獨立進行研究所取得的成果。盡我所知，除文中特別加以標注和致謝所列內(nèi)容外，論文中不包含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得吉林農(nóng)業(yè)大學或其它教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。本學位論文所有內(nèi)容若有不實之處，本人愿意承擔一切相關(guān)法律責任和后果。學位論文作者簽名：簽字日期：年月日關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明1、本人完全了解
3、吉林農(nóng)業(yè)大學有關(guān)保留和使用學位論文的規(guī)定，即：研究生在校攻讀學位期間所完成的論文及相關(guān)成果的知識產(chǎn)權(quán)屬吉林農(nóng)業(yè)大學所有，并同意將本論文的版權(quán)授權(quán)給吉林農(nóng)業(yè)大學，學校有權(quán)保留送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。2、本人（同意/不同意，務必打印后填寫）吉林農(nóng)業(yè)大學將本論文版權(quán)授權(quán)給不同媒體進行電子出版、多媒體出版、網(wǎng)絡出版以及其他形式出版（涉密學位論文解密后應遵守此協(xié)議）。3、本人聲明畢業(yè)后若發(fā)表在攻讀研究生學位期間完成的論文及相關(guān)的學
4、術(shù)成果，必須以吉林農(nóng)業(yè)大學作為第一署名單位。學位論文作者簽名：簽字日期：年月日導師簽名：簽字日期：年月日摘要鹿結(jié)核病主要是由牛分枝桿菌引起的一種慢性、消耗性人畜共患病，該病程世界分布，嚴重威脅人類的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。隨著鹿養(yǎng)殖數(shù)量的不斷增加，飼養(yǎng)員因接觸病畜而感染結(jié)核的病例也逐年攀升，因此，控制鹿結(jié)核病的蔓延不但有助于降低養(yǎng)鹿業(yè)的經(jīng)濟損失，也降低了飼養(yǎng)員的患病風險。目前，卡介苗（BCG）可以預防鹿結(jié)核病。動物接種BCG一段時間內(nèi)結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗結(jié)果呈假陽性，嚴重影響結(jié)核菌素的皮內(nèi)試驗檢測結(jié)果。
5、RD1區(qū)和RD5區(qū)均在結(jié)核分枝桿菌中存在，在卡介苗中缺失。有資料證實RD5區(qū)的Rv3117基因能夠區(qū)分動物結(jié)核病是自然感染還是卡介苗免疫，且其敏感性和特異性均高于ESAT-6蛋白。本研究克隆、表達并純化了Rv3117蛋白，誘導表達了實驗室保存的RD-1區(qū)基因的重組表達質(zhì)粒并對其進行純化獲得Rv3117、Rv3872、Rv3873、Rv3874、Rv3875、Rv3878、Rv3874-3875和Rv3872-3874-3875蛋白。利用ELISA方法綜合評價各蛋白作為鹿結(jié)核病ELISA檢測方法的
6、候選抗原的敏感性和特異性，篩選出最優(yōu)抗原Rv3872-3874-3875蛋白，建立一種能夠鑒別鹿結(jié)核病野毒株感染與卡介苗免疫的方法，從而降低鹿結(jié)核病ELISA檢測的假陽性。本研究主要包括以下幾方面內(nèi)容：（1）Rv3117基因的克隆與表達載體的構(gòu)建以結(jié)核分枝桿菌標準菌H37Rv為模板，設計特異性引物，擴增只在結(jié)核分枝桿菌中存在，而在卡介苗中缺失的RD5區(qū)的基因Rv3117。將目的基因Rv3117與克隆載體pMD18-T連接，經(jīng)鑒定結(jié)果顯示已將Rv3117基因成功克隆至克隆載體上。將Rv3117基因
7、片段連接至表達載體pGEX-4T-1上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，篩取陽性克隆。（2）結(jié)核分枝桿菌野毒株與卡介苗差異基因的誘導表達及純化對前期制備的pGEX-4T-1-Rv3117的菌種進行誘導表達，用Westernblot方法檢驗其是否具有結(jié)核分枝桿菌的反應原性。大量誘導表達Rv3117蛋白和實驗室保存的結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)特異性基因的菌種。用親和層析的方法對其進行純化，并對純化結(jié)果進行SDS-PAGE分析。（3）鑒別鹿結(jié)核病野毒感染與卡介苗免疫間接ELISA檢測方法最優(yōu)抗
8、原的篩選本試驗制備兔人工感染結(jié)核分枝桿菌、卡介苗和副結(jié)核分枝桿菌的陽性血清，以差異基因蛋白為包被抗原，分別建立間接ELISA方法，比較各包被抗原建立的間接ELISA方法的重復性、敏感性和特異性。結(jié)果表明Rv3872-74-75蛋白具有較高的重復性、敏感性和特異性，可以區(qū)分野毒感染和卡介苗免疫，為后期建立鑒別鹿結(jié)核病野毒株與卡介苗免疫ELISA檢測方法做準備。（4）鑒別鹿結(jié)核病野毒感染與卡介苗免疫間接ELISA方法的建立及初步應用建立檢測鹿結(jié)核病的Rv3872-74-75-ELISA方法，并用PP
